* Phân tích trình tự gen tcpA mã hóa toxin coregulated pilus từ V. cholera O1
El Tor
Cặp mồi để phát hiện gen tcpA và rstR đặc hiệu để phân biệt biotype V. cholera O1 El Tor và biotype V. cholera O1cổ điển (Classical) cũng được thiết kế căn cứ vào sự tương đồng về trình tự nuclêơtít của tcpA và rstR.
Từ 6 chủng V. cholera O1 El Tor đã được nghiên cứu chúng tơi so sánh trình tự nucleotit để thiết kế cặp mồi thích hợp nhằm khuếch đại đoạn gen tcpA đặc hiệu cho biotype V. cholera O1 El Tor bằng phản ứng PCR.
Bảng 3.7. Danh sách các chủng V. cholera O1 El Tor đã được sử dụng để thiết kế mồi
STT Mã số trên ngân hàng
gen (Genbank NCBI) Tên chủng
1 KC918816 Vibrio cholerae O1 strain IDH03532
2 KC918812 Vibrio cholerae O1 strain M15175
4 KC918810 Vibrio cholerae O1 strain K8833
5 KJ437651 Vibrio cholerae strain MJ-51
6 EU362122 Vibrio cholerae strain A199
Sự tương đồng về trình tự gen mã hóa của các gen tcpA của 6 chủng V. cholera O1 biotype El Tor trên được thể hiện trong hình 3.9.
gi| gb|KC918816.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KC918812.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KC918811.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KC918810.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KJ437651.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |EU362122.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA ************************************************************ gi| |KC918816.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KC918812.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KC918811.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KC918810.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KJ437651.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACGCTACTCGAAGTGATCATCGTTCTAGGCATTATGGGTGTG gi| |EU362122.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACACTACTCGAAGTGATCATCGTTCTAGGTATTATGGGTGTG ******************** ********** ***** ***** ** ************ gi| |KC918816.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KC918812.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KC918811.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KC918810.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KJ437651.1| GTTGGTAATACAGGTAAAGGTGTTATTAAGTCTATAGCTACAGG---TGTTAATTTAAAC gi| |EU362122.1| GTTGGTAATACAGATAAAGGTGTTATTAAGTCTATAGCTACAGG---TGTTAATTTAAAC * ** * *** * ** ** ******** ** ** **** ** ** ****** gi| |KC918816.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KC918812.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KC918811.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KC918810.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KJ437651.1| TTAACAGACGTAACGCACGTGGA gi| |EU362122.1| TTAACAGACGTAACGCACGTGGA
**** * * ***** ****** **
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của gen tcpA từ 6 chủng V.
cholera O1 biotype El Tor [68]
Dựa vào kết quả so sánh trình tự nucleotide từ 6 chủng V. cholera O1 biotype El
Tor ( Hình 3.9) chúng tơi nhận thấy chỉ có sự sai khác ở trình tự nucleotide 434, 441 và
448 ở đầu 3’, khơng có sự khác nhau ở đầu 5’. Tuy nhiên sự khác nhau này chỉ xảy ra giữa chủng Vibrio cholerae strain MJ-51 (KJ437651) và Vibrio cholerae strain A199
cholerae O1 strain M15175 (KC918812), Vibrio cholerae O1 strain L4706 (KC918811), Vibrio cholerae O1 strain K8833 (KC918810) nên có thể sử dụng trình tự ADN mã hóa cho một trong 4 chủng này để thiết kế mồi khuếch đại gen tcpA.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gen tcpA của Vibrio cholerae O1 strain
IDH03532 được đăng ký trên Genbank mã số KC918816 đã được phân tích kĩ [68] và
dịch mã trong hệ biểu hiện của V. cholerae để thiết kế mồi. Trình tự gen này được thể hiện trong hình 3.10.
ORIGIN
1 ATGCAATTAT TAAAACAGCT TTTTAAGAAG AAGTTTGTAA AAGAAGAACA CGATAAGAAA 61 ACCGGTCAAG AGGGTATGAC ACTACTCGAA GTGATCATCG TTCTAGGTAT TATGGGTGTG 121 GTTTCGGCGG GGGTTGTTAC TCTGGCGCAG CGTGCGATTG ATTCGCAGAA TATGACCAAG 181 GCCGCGCAAA ATCTAAATAC AATTCAAGTT GCAATGACTC AAACCTATCG TAGTCTAGGT 241 TCGTACCCTA CAACAGCTGA TGCAAATGCG GCCGGACGTT TGACATCTGG ATTGGTAAGT 301 TTGGGTAAGA TTTCTGCAGA CGAAGCAAAA AACCCATTTA CTGGGACTAA TATGAACATC 361 TTTGCTTTCA GCCGAAATAC AGCACCTCAG AAAGCCTTTG CTATTGCAGT TGACGGTTTG 421 ACAAAAGCAC AATGTAAATC GCTTGTTACA AGTGTCGGTG AAATGTTCCC TTACATTGTA 481 GTTAAGGAAG GTGCTGCTGT CGAAAATGCT GACCTAAAGG ACTTTGAAAC AGAAGCTCCT 541 GTTGGTAATA C
Hình 3.10. Trình tự gen tcpA từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi [68].
* Phân tích trình tự gen rstR mã hóa toxin coregulated pilus từ V. cholera O1 biotype Classical
Căn cứ vào sự tương đồng về trình tự nucleotit của gen rstR mã hóa toxin coregulated pilus từ 6 chủng V. cholera O1 biotype Classical đã được nghiên cứu để phân biệt biotype El Tor với V. cholera O1 biotype classical (Bảng 3.8), các cặp mồi thích hợp nhân đoạn gen rstR bằng phản ứng PCR đã được thiết kế.
Bảng 3.8. Danh sách các chủng V. cholera O1 đã được nghiên cứu để thiết kế mồi nhân gen rstR
STT Mã số gen appA trong ngân
hàng gen (gene bank) Tên chủng
1 EU860439 Vibrio cholerae O1 biovar Classical strain VC44 RS1
2 KB663057 Vibrio cholerae O1 str. AG-8040
3 KJ540268 Vibrio cholerae strain PM13
4 KJ437641 Vibrio cholerae strain MJ-51
5 JX312669 Vibrio cholerae strain MCM168
6 CM001786 Vibrio cholerae O1 str. Inaba G4222
Sự tương đồng về trình tự gen mã hóa của gen rstR mã hóa toxin coregulated pilus từ 8 chủng V. cholera O1 biotype Classical trên được thể hiện trong hình 3.14 và 3.15.
gi| |EU860439| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG
gi| |KB663057| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| |KJ540268| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| | KJ437641| GACGGAATGAAGCATAAGGAACGGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| |JX312669| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| |CM001786| GACGGAATGAAGCATAAGGAAGCGACCAAGCAAGATGATCGACAAAAACAAACGGAGAAG ********************* ************* *********************** gi| | EU860439| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | KB663057| CGTTTGTATCGAGTTGTAAATCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | KJ540268| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | KJ437641| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | JX312669| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | CM001786 CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAACCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA ******************* **************************************** gi| | EU860439| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA
gi| | KB663057| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | KJ540268| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | KJ437641| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | JX312669| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | CM001786 GTCAGCGATAGGGAAACAAACATTGACGAA **********************************
Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 6 gen mã hóa toxin coregulated pilus có nguồn gốc từ V. cholera O1 biotype Classical [68]
Dựa vào kết quả so sánh trình tự trình tự nucleotide của 6 gen mã hóa toxin coregulated pilus có nguồn gốc từ V. cholera O1 biotype El Tor (Hình 3.11) chúng tơi nhận thấy khơng có sự sai khác trình tự nucleotit nào ở 5’ và đầu 3’, như vậy cả 6 chủng
đều có thể sử dụng trình tự ADN để thiết kế mồi khuếch đại gen rstR.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gen rstR của Vibrio cholerae strain
MCM168 được đăng ký trên Genbank mã số JX312669 đã được phân tích kĩ [68] và dịch
mã trong hệ biểu hiện của V. cholera để thiết kế mồi. Trình tự gen này được thể hiện
trong hình 3.12.
ORIGIN
1 ATGAAGATAA AAGAAAGGCT AGCCAACCAA AGAAAGGCAA TTAATAAGAC TCAGGCACAA 61 ATGGCTGATG AAATTGGAAT TAGTCTAACA TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT 121 TTGCCTACAA TGGAAAACCT TGTGAAGATC GCAGATGCTC TGGAGATCTC AATTGATGAA 181 CTATGCGGAA GATGGGCCAC AGATGAAAAT CAAGAGCTTA TGCTCAGGTT AAAAAAAATC 241 CAACAGTTAG ATGAAGAAGA GCAAAAAGCA ATAAGCATGG TTTTAGAAAG TATGCTGATA 301 AGACATTCTA CCAAGAGCAT CTTAAATCAT GGTGCTTAGT GCTGCTGAGA TGCTCAGGTT 361 TGCTCAGGTT AAATTGGAAT AGATGAAAAT CAAGAGCTTA TTTTAGAAAG AATTGATGAA 421 AGATGAAAAT GATGGGCCAC ACCTCGTACA CAAGAGCTTA TGCTCAGGTT AATTGATGAA 481 AATTGATGAA TGGAAAACCT TGTGAAGATC TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT 541 TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT 601 caacagttag cttaaatcat
Hình 3.12. Trình tự gen rstR từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi [68].
3.1.2. Thiết kế mồi nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR từ V. Cholerae
Thiết kế mồi nhân gen gen ctxA
ctxA-F: 5’ TGGGCAGATT CTAGACCTCC TG 3’ ctxA-R: 5’ CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC 3’
Trong đó ctxA-F: Mồi xi ctxA ctxA-R: Mồi ngược ctxA
Trình tự nucleotide từ 1 đến 22 (Hình 3.4) được dùng để thiết kế mồi xi (ctxA-
F). Đoạn trình tự nucleotide từ 541 đến 564 (Hình 3.4) được sử dụng để thiết kế mồi
ngược (ctxA-R).
Thiết kế mồi nhân gen rfbQ từ V. Cholerae
O1 rfbF: 5’AGCGAGTCAATCAACCCATC 3’ O1 rfbR: 5’ CCCAGCATTCGTGACCCGAC 3’ Trong đó O1 rfbF: Mồi xi rfbQ O1 rfbR: Mồi ngược rfbQ
Trình tự nucleotide từ 4 đến 23 (Hình 3.6) được dùng để thiết kế mồi xuôi (O1
rfbF). Đoạn trình tự nucleotide từ 173 đến 192 (Hình 3.6) được sử dụng để thiết kế mồi
ngược (O1 rfbR).
Thiết kế mồi nhân gen IS1358 từ V. Cholerae O139
O139 rfbF: 5’ CAGGGAACCGCATGAAGGTCG 3’
O139 rfbR: 5’ AATGAAGCTTCTTGCAAAGCTAACGG 3’ Trong đó O139 rfbF: Mồi xuôi IS1358
O139 rfbR: Mồi ngược IS1358
Trình tự nucleotide từ 1 đến 21 (Hình 3.8) được dùng để thiết kế mồi xi (O139
rfbF). Đoạn trình tự nucleotide từ 423 đến 449 (Hình 3.8) được sử dụng để thiết kế mồi
ngược (O139 rfbR).
Thiết kế mồi nhân gen tcpA từ V. Cholerae O1 Classical
tcpA-F: 5’ CAATTATTAAACGCTTTAAGAG 3’ tcpA-R: 5’ TCCACGTGCGTTACGTCTGTTAAG 3’
Trong đó tcpA-F: Mồi xi tcpA tcpA-R: Mồi ngược tcpA
Trình tự nucleotide từ 4 đến 25 (Hình 3.10) được dùng để thiết kế mồi xi
(tcpA-F). Đoạn trình tự nucleotide từ 596 đến 620 (Hình 3.10) được sử dụng để thiết kế mồi ngược (tcpA-R).
Thiết kế mồi nhân gen rstR từ V. Cholerae O1 EL Tor
rstR-F: 5’AAGATAAGAAGGCTAGCC 3’ rstR-R: 5’TGTACGAAGGAGGCCATC 3’
Trong đó rstR-F: Mồi xuôi rstR rstR-R: Mồi ngược rstR
Trình tự nucleotide từ 1 đến 18 (Hình 3.12) được dùng để thiết kế mồi xuôi (rstR-
F). Đoạn trình tự nucleotide từ 433 đến 451 (Hình 3.12) được sử dụng để thiết kế mồi
ngược (rstR-R).
3.3. Khuếch đại gen ctxA, rfb từ V. Cholerae bằng phản ứng m-PCR1
Phản ứng PCR này sử dụng Phusion HF ADN polymerase (#K0191), đây là enzyme chịu nhiệt chính xác nhất hiện nay, với tỉ lệ lỗi thấp hơn 50 lần so với Taq polimeraza và 6 lần so với Pfu polimeraza. Tính năng này làm cho Phusion HF ADN polimeraza là sự lựa chọn tốt nhất cho việc nhân gen với hiệu suất cao. Theo tính tốn lý
thuyết, đoạn ctxA và rfb (O1 và O139) sau khi được tổng hợp bằng kỹ thuật PCR với cặp
mồi thiết kế như trên sẽ có chiều dài khoảng 302 bp, 192bp và 449bp. Phản ứng m-PCR1
sử dụng 3 cặp mồi, cặp mồi thứ nhất được thiết kế dựa vào gen ctxA đặc trưng cho
V. cholerae, cặp mồi thứ 2 và thứ 3 được thiết kế để phân biệt hai serogroup O1 và O139
các mẫu dương tính đồng thời ít nhất 2 gen ctxA và rfbO1 được ghi nhận để tiếp tục thực hiện phản ứng m-PCR2 nhằm xác định biotype El Tor hoặc cổ điển của V. cholerae O1.
Tuy nhiên nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu với lượng lớn chúng tôi đã tiến hành các phản ứng PCR với sự thay đổi về nồng độ ADN khn, chu kì nhiệt, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ enzyme Phusion HF DNA polimeraza như sau:
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các thông số trong chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR
khuếch đại gen ctxA, rfb
Phản ứng PCR nhân gen Chu kì nhiệt Nhiệt độ gắn mồi (C) Nồng độ enzyme HF (u/µl) Nồng độ ADN khn (ng/ µl) Kết quả ctxA, rfb 35 47 1 u/ 50µl 1µl ADN khn - ctxA, rfb 35 50 1 u/ 50µl 1µl ADN khn - ctxA, rfb 30 50 1 u/ 50µl 5µl ADN - ctxA, rfb 30 50 1 u/ 50µl 1µl ADN - ctxA, rfb 35 52 1 u/ 50µl 1µl ADN - ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 2µl ADN - ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 3µl AND - ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 3µl ADN - ctxA, rfb 30 50 1 u/ 50µl 1µl ADN + ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 1µl ADN - ctxA, rfb 35 52 1 u/ 50µl 3µl ADN - ctxA, rfb 35 52 1 u/ 50µl 1µl AND - ctxA, rfb 30 52 2 u/ 50µl 3µl ADN +++ ctxA, rfb 30 52 1,5 u/ 50µl 3µl AND + ctxA, rfb 30 52 2 u/ 50µl 3µl AND + ctxA, rfb 20 52 2 u/ 50µl 3µl AND + ctxA, rfb 30 52 2 u/ 50µl 5µl AND ++ Ghi chú:
“ – ’’ Khơng có sản phẩm PCR “ + ’’ Có lượng nhỏ sản phẩm PCR
“ ++’’ Có lượng trung bình sản phẩm PCR “ +++’’ Có lượng lớn sản phẩm PCR
Sau khi điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 47C lên 52C, nồng độ Phusion HF DNA polimeraza 1u/50µl lên 2u/50µl, 20 chu kì nhiệt lên 30 chu kì, 3µl ADN khn, sản phẩm
PCR nhân gen ctxA, rfb thu được là khá đặc hiệu (hình 3.17). Sản phẩm thu được của
phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm m-PCR1 nhân gen gen ctxA, gen rfb O1 và rfb O139
M: Thang ADN chuẩn 100bp ĐC-: Đối chứng âm
O1: Đối chứng dương mang gen ctxA (302bp) và rfbQ (192bp) O139: Đối chứng dương mang gen ctxA (302bp) và IS1358 (449bp)
1-10: các mẫu
Kết quả điện di 302 bp, 192bp, 449bp tương đương với kích thước của đoạn ctxA,
rfbO1 và rfbO139 cần khuếch đại theo tính tốn lý thuyết. Các vệt mờ xung quanh là các
sản phẩm không đặc hiệu, tuy nhiên nồng độ của chúng không đáng kể để tạo thành các
băng/vạch rõ nét. Điều này chứng tỏ cặp mồi thiết kế cho các gen ctxA, rfbO1 và rfbO139
mang tính đặc hiệu cao và chương trình chạy m-PCR1 cho phản ứng này là hoàn toàn phù
M ĐC- ĐC+ ĐC+ 1 2 3 4 5 6 10 9 8 7 ĐC+ ĐC+ ĐC- M 449bp 302bp 192bp 192bp 302bp 449bp
hợp. Sản phẩm PCR này được sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
Chu trình phản ứng m – PCR1 đã được tối ưu để khuếch đại các đoạn gen ctxA,
rfbO1 và rfbO139 sử dụng cặp mồi đã được thiết kế ở mục 3.2 như sau: bước biến tính ở
94°C trong 1 phút 30 giây, kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây) và kết thúc với pha hoàn tất ở 72°C trong 7 phút.
Thực nghiệm cho thấy các cặp gen mồi đều cho kết quả dương tính ở cả 2 chủng O1 và O139 vi khuẩn tả đã được phân lập từ các vụ dịch trước đây (đối chứng +) và các cặp gen mồi này không khuếch đại hệ gen của các vi khuẩn gặp ở đường tiêu hóa như vi
khuẩn Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp,
E. coli ATCC 11775 như kết quả ở hình trên (đối chứng – Hình 3.13).
Nhiều nghiên cứu gần đây xác định một số chủng vi khuẩn tả Vibrio cholerae O1 ở
trong mơi trường tự nhiên khơng có độc tố, những chủng này có thể trở thành sinh độc tố khi nhiễm bởi một phage có mang đoạn gen độc tố CTX, sự biến đổi này chỉ xảy ra trong đường tiêu hóa của người hay động vật [6]. Như vậy việc khuếch đại 2 vùng gen đặc trưng của vi khuẩn tả (một vùng gen mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu O1, và một vùng gen cho độc tố tả) làm cho quy trình khuếch đại có thể dùng để xác định vi khuẩn tả với nguồn bệnh phẩm từ người bệnh và cả từ các nguồn nước trong môi trường.
Kết quả 16 mẫu trong 162 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu dương tính đồng thời gen
ctxA và gen rfbO1 hoặc/ và rfbO139 cho thấy khả năng hiện diện các V. cholerae mang
gen độc lực trong mẫu bệnh phẩm. Tần số xuất hiện của các serogroup mang gen độc lực
của V. cholerae trong mẫu bệnh phẩm rất thấp. Điều đó cho thấy các serogroup của V.
cholerae tồn tại trong mẫu bệnh phẩm cũng như trong môi trường chủ yếu là non-O1,
O139 [32] hoặc những dịng V. cholerae O1 và O139 khơng sinh độc tố CT [37]. Chúng
tôi tiến hành định biotype của 16 mẫu cho kết quả dương tính đồng thời với ít nhất 2 gen
của V. cholerae O1 bằng phản ứng m-PCR2.
3.4. Khuếch đại gen tcpA, rstR từ V. Cholerae bằng m-PCR2
Các mẫu dương tính đồng thời ít nhất 2 gen ctxA và rfbO1 được ghi nhận để tiếp tục thực hiện phản ứng m-PCR2 nhằm xác định biotype El Tor hoặc cổ điển của V.
cholerae O1. Các đoạn mồi được thiết kế phân biệt hai biotype dựa vào gen tcpA và rstR.
620bp chúng tôi đã tiến hành các phản ứng PCR với sự thay đổi về nồng độ ADN, chu kì nhiệt, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ enzyme Phusion HF DNA polimeraza như sau:
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các thông số trong chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR
khuếch đại gen tcpA, rstR từ V. Cholerae bằng m-PCR2
Phản ứng PCR nhân gen Chu kì nhiệt Nhiệt độ gắn mồi (0C) Nồng độ enzyme HF (u/µl) Nồng độ AND khn (ng/ µl) Kết quả tcpA và rstR 30 57 1 u/ 50µl 1µl - tcpA và rstR 30 57 1 u/ 50µl 1µl - tcpA và rstR 35 57 1 u/ 50µl 1µl ADN - tcpA và rstR 35 57 1 u/ 50µl 1µl ADN - tcpA và rstR 30 55 1 u/ 50µl 3µl - tcpA và rstR 35 55 1 u/ 50µl 1µl - tcpA và rstR 30 52 1 u/ 50µl 3µl - tcpA và rstR 35 52 1 u/ 50µl 1µl - tcpA và rstR 30 50 1 u/ 50µl 3µl + tcpA và rstR 30 50 1 u/ 50µl 5µl + tcpA và rstR 35 50 1 u/ 50µl 3µl ADN + tcpA và rstR 25 50 1 u/ 50µl 5µl ADN + tcpA và rstR 30 47 1 u/ 50µl 3µl ++ tcpA và rstR 35 47 1 u/ 50µl 5µl ADN ++ tcpA và rstR 30 47 2 u/ 50µl 5µl ADN ++ tcpA và rstR 30 47 2 u/ 50µl 3µl ADN +++ tcpA và rstR 20 52 2 u/ 50µl 5µl ADN + Ghi chú: “ – ’’ Khơng có sản phẩm PCR “ + ’’ Có lượng nhỏ sản phẩm PCR “ ++’’ Có lượng trung bình sản phẩm PCR
“ +++’’ Có lượng lớn sản phẩm PCR
Sau khi điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 57C xuống 47C, nồng độ Phusion HF DNA polimeraza 1u/50µl lên 2u/50µl, 20 chu kì nhiệt lên 30 chu kì, 3 µl ADN khuôn, sản
phẩm PCR nhân gen tcpA và rstR thu được là khá đặc hiệu. Sản phẩm thu được của phản
ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.