2.4.3. Kỹ thuật nuôi cấy [16]
- Kỹ thuật nuôi cấy: lấy bệnh phẩm nhƣ với kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp. Bệnh
phẩm đƣợc ria trên môi trƣờng Thayer - Martin bằng những đƣờng zich zắc hoặc kỹ thuật cấy phân vùng. Để đĩa thạch cấy vào tử ấm nhiệt độ 36- 37ºC, khí trƣờng CO2 từ 3- 10%, độ ẩm trên 70%. Sau 18-24 giờ quan sát khuẩn lạc. Nếu chƣa thấy vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa.
Hình 2.2. Vi khuẩn lâ ̣u trên môi trƣờng Thayer - Martin
- Test oxydase:
+ Thử trên dải giấy thấm Whatman: dùng đầu pepette pasteur uốn cong trên ngọn lửa đèn cồn, lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên dải giấy thấm Whatman No1 kích thƣớc 2,5x0,5 cm đã đƣợc làm ẩm bằng 2-3 giọt thuốc thử tetramethyl p – phenylendiamin hydroclord 1%.
+ Test oxidase làm trực tiếp trên khuẩn lạc của đĩa thạch ni cấy.
Phản ứng dương tính: trong vòng 5 giây khuẩn lạc từ màu đỏ chuyển sang màu tím
đậm vì có những vi khuẩn có men oxidase khi tiếp xúc thuốc thử tetramythyl - p – phenul endiamin hydroclorid 1% sự có mặt của oxy ngồi khơng khí sẽ chuyển màu.
- Test enzyme Remel BactiCard Neisseria
Nguyên lý: sử dụng hệ thống các enzyme, để xác định các loài Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica và Moraxella catarrhalis.
Vật liệu dùng để xác định gồm một thanh có 4 vịng trịn thử nghiệm, thanh giếng đƣợc tẩm các chất tạo màu với indoxyl butyrate esterase (IB), prolyl
aminopeptidase (PRO), gamma-glutamyl aminopeptidase (GLUT), và beta- galactosidase (BGAL).
Các chất tạo màu cho phép định danh các vi khuẩn tƣơng ứng M.catarrhalis,
N.gonorrhoeae, N.meningitidis, và N.lactamica. Enzym BGAL (của N.lactamica)
thủy phân 5-bromo-4- chloro-3indolyl-β-D galactoside và IB (của M.catarrhalis)
thủy phân 5-bromo- 4-chloro- 3-indolyl butyrate trong điều kiện có oxy để tạo thành phức hợp màu xanh lá cây. GLUT (của N.meningitidis) thủy phân gamma-
glutamyl-β-naphthylamide và PRO (của N.gonorrhoeae) thủy phân L-proline-β-
naphthylamide để tạo thành màu đỏ.
Kết quả định danh bằng BactiCard Neisseria cho 558 chủng phân lập, đƣợc đối chiếu với kết quả định danh bằng phƣơng pháp thông thƣờng trong một thử nghiệm mù. Các BactiCard Neisseria xác định đúng 254/254 chủng Neisseria gonorrhoeae (đạt 100%), 125/125 chủng Neisseria meningitidis (đạt 100%), 53/54
chủng Neisseria lactamica (đạt 98,2%), và 123/125 Moraxella catarrhalis (đạt
98,4%).
Đây là một test đƣợc thực hiện nhanh chóng và cho kết quả chính xác để xác định các vi sinh vật trong phịng thí nghiệm.
+ Chuẩn bị: thẻ test Bacti Card Neisseria gồm thành phần các chất phản ứng: - 5-bromo-4- chloro-3 indolyl-β-D-galactoside (BGAL)
- 5-bromo- 4-chloro- 3-indolylbutyrate (IB) - Gamma-glutamyl-β-naphthylamide (GLUT) - L-proline-β-naphthylamide (PRO)
- Rehydrating fluid (1lọ, 6ml) có chứa cất bảo quản
-Chất tạo màu (1 lọ, 6ml) có thành phần 0,02% p- dimethylaminocinnamaldehyde.
+ Các bƣớc tiến hành (theo đúng thƣờng quy của hƣớng dẫn kit)
Phết khuẩn lạc phân lập đƣợc lên mỗi vòng tròn test, nhỏ vào mỗi vòng tròn test một giọt rehydrating fluid đƣợc cung cấp trong bộ kit. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
Quan sát vòng tròn IB nếu cho kết quả màu xanh lá cây là dƣơng tính (M.catarrhalis). Nếu IB âm tính, tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng thêm 13 phút (tổng thời gian kiểm tra là 15 phút).
Quan sát vòng tròn BGAL nếu cho kết quả màu xanh lá cây là dƣơng tính (N.lactamica). Nếu BGAL âm tính, nhỏ một giọt chất tạo màu vào vịng tròn PRO và GLUT. Quan sát sự chuyển màu hồng sang màu đỏ là dƣơng tính nếu PRO là (N.gonorrhoeae) và GLUT là (N.meningitidis).
Hình 2.3. Remel BactiCard Neisseria 2.4.4. Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác đi ̣nh vi khuẩn lâ ̣u 2.4.4. Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác đi ̣nh vi khuẩn lâ ̣u
Nhuộm soi: có song cầu khuẩn Gram âm hình ha ̣t cà phê nằm trong và ngoài bạch cầu đa nhân trung tính.
Ni cấy: thấy khuẩn la ̣c da ̣ng S lấp lánh nhƣ gio ̣t sƣơng và có màu hơi xám . Lấy khuẩn la ̣c nhuô ̣m Gram thấy song cầu hình ha ̣t cà phê bắt mà u Gram âm đa dạng.
Test oxidase dương tính
Test enzyme Remel BactiCard Neisseria dương tính
2.4.5. Kỹ thuâ ̣t làm kháng sinh đồ
Tiến hành theo kỹ thuâ ̣t khuếch tán trên t hạch của WHO khuyến cáo cho chƣơng trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lâ ̣u khu vƣ̣c Châu Á – Thái Bình Dƣơng sử dụng môi trƣờng Thayer – Martin không có chất ƣ́c chế.
Cách tiến hành
- Pha canh khuẩn: Lấy khuẩn la ̣c vi khu ẩn lậu đã nuối cấy 18-24 giờ hòa đều với nƣớc muối sinh lý NaCl 0,9% so với đô ̣ đu ̣c tiêu chuẩn Mc .Farland 0,5 (tƣơng đƣơng với vi khuẩn/ml)
- Dùng pipette hút canh khuẩn láng đều trên bề mặt đĩa thạch có đƣờng kính 9cm với đơ ̣ dày 4mm. Hút bỏ bớt canh khuẩn thừa trên đĩa thạch . Để khô mă ̣t tha ̣ch ở nhiệt độ phòng.
- Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt đĩa thạch (đƣờng kính 9cm đă ̣t 6 khoanh) khoanh giấy cách thành đĩa tha ̣ch 2 cm để khoảng 10 phút để kháng sinh khuếch tán đều.
- Ủ trong tủ ấm ở nhiê ̣t đô ̣ 36-37ºC, nồng đô ̣ CO2 từ 3-10%, đô ̣ ẩm trên 70%. Đo ̣c kết quả sau đó 18 đến 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng vô khuẩn tính bằng mm, so sánh với bảng tiêu chuẩn CLSI 2015
Đánh giá kết quả: đo đƣờng kính vòng vơ kh̉n bằng thƣớc tính bằng mm + S (Susceptible): nhảy cảm
+ I (Intermediate): trung tính + R (Resistant): đề kháng
So với bảng tiêu chuẩn:
+ Nếu vòng vô khuẩn rõ ràng thì đo đƣờng kính tính ra mm.
+ Nếu mép vòng vô khuẩn không rõ ràng : Đọc 80% đƣờng kính vòng vô khuẩn.
+ Nếu trong vùng ƣ́c chế có mô ̣t vài khuẩn la ̣c thì lấy khuẩn la ̣c đó ra nhuô ̣m Gram, nếu là vi khuẩn lâ ̣u thì vẫn đo đƣờng kính vùng ƣ́c chế nhƣ bình thƣờng.
+ Nếu vòng vơ kh̉n không tròn đều thì cho ̣n rìa nào tròn nhất để đo đƣờng kính.
Bảng 2.3. Bảng chuẩn kháng sinh đờ
Kháng sinh Nờng đơ ̣ (µg) Ký hiệu R I S Penicillin 10 PG ≤26 27-46 ≥47 Ceftriaxone 30 CRO - - ≥35 Ciprofloxacin 5 CIP ≤27 28-40 ≥41 Spectinomycin 100 SPT ≤14 15-17 ≥18 TRNG* 30 TE ≤30 31-37 ≥38 Azithromycin 15 AZM - - ≥20 Cefotaxime 30 CTX - - ≥31
Nalidixic Acid 30 NAL ≤9 10-31 ≥32
Cefixime 5 CFM - - >31
2.4.6. Kỹ thuâ ̣t xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Nguyên lý: kháng sinh đƣợc tẩm lên băng giấy vơi nồng độ lỗng dẫn khuếch tán trên mơi trƣờng, vi kh̉n không phát triển ở nơi có nồng đô ̣ cao ta ̣o thánh vùng vơ kh̉n (hình elip ). Nờng đơ ̣ kháng sinh thấp nhất t rên băng giấy ƣ́ng với ranh giới giƣ̃a nơi vi khuẩn phát triển và không phát triển đƣợc go ̣i là nồng đô ̣ ƣ́c chế tối thiểu của kháng sinh với vi khuẩn (MIC).
Các bƣớc tiến hành:
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậ u ni cấy 18-24 giờ. Hịa đều vi khuẩn với NaCl 0,9%.
So sánh đô ̣ đu ̣c tiêu chuẩn của Mc Farland 0,5.
Dùng pipette hút canh khuẩn láng đều trên bề mặt đĩa thạch có đƣờng kính 9cm với đơ ̣ dày 4mm. Hút bỏ bớt canh khuẩn thừa trên đĩa tha ̣ch.
Để khô mă ̣t tha ̣ch ở nhiê ̣t đô ̣ phòng khoảng 10 phút
Đặt các thanh giấy kháng sinh E -test, để khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng cho kháng sinh ở các thanh giấy khuếch tán đều .
Để vào tủ ấm nhiệt độ 36-37ºC, nồng đô ̣ CO2 tƣ̀ 3- 10%, đô ̣ ẩm trên 70%. Sau 18-24
giờ đem ra đo ̣c kết quả.
Cách đọc kết quả:
Khi vùng ƣ́c chế 2 bên thanh thƣ̉ rõ ràng , kết quả MIC đƣợc đánh giá ƣ́ng
với nồng đô ̣ kháng sinh in trên thanh thƣ̉ ta ̣i góc bé bi ̣ ƣ́c chế.
Khi vùng ức chế ở 2 bên thanh thƣ̉ không đều nhau , kết quả đƣợc đánh giá ở
phía vừng ức chế có giá trị nồng độ kháng sinh cao hơn.
Khi vùng ƣ́c chế vi khuẩn thấp hơn giá trị nhỏ nhất của thanh thử , kết quả
đƣơ ̣c đánh giá là nhỏ hơn giá trị thấp nhất của nồng độ kháng sinh in trên thanh thƣ̉.
Khi vi khuẩn phát triển do ̣c theo 2 bên thanh thƣ̉, kết quả đƣợc đánh giá ở giá
trị nồng độ kháng sinh cao nhất.
2.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu đƣợc nhập trên chƣơng trình SPSS16.0. Các thuật toán đƣợc sử dụng: tỉ lệ %, kiểm định…
2.6. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Da Liễu Trung Ƣơng. Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2017 - 10/2017.
2.7. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
Bệnh nhân sau khi đã đƣợc giải thích rõ về mục đích yêu cầu của nghiên cứu và đồng ý tham gia mới đƣa vào danh sách nghiên cứu.
Lấy bệnh phẩm chỉ phục vụ cho chẩn đốn, khơng làm xét nghiệm khác.
Các thông tin cá nhân nhƣ tên, tuổi, địa chỉ, nghề nghiệp của đối tƣợng nghiên cứu đƣợc giữ bí mật bằng cách đánh mã số cho từng bệnh nhân và chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. TỈ LỆ BỆNH NHÂN MẮC BỆNH LẬU TRONG TỔNG SỐ BỆNH NHÂN CÓ HCTDNĐ CÓ HCTDNĐ
3.1.1. Tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh lậu
Bảng 3.1. Tỉ lệ bệnh nhân nhiễm lậu trên tổng số bệnh nhân HCTDNĐ
Kết quả Nhuộm Gram Nuôi cấy
n Tỷ lệ % n Tỷ lệ %
Âm tính 1656 92,62 1648 92,17
Dƣơng tính 132 7,38 140 7,83
Tổng 1788 100 1788 100
Hình 3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lâ ̣u ở bê ̣nh nhân có hô ̣i chƣ́ng tiết dịch niệu đa ̣o/âm đa ̣o theo tháng trong năm
Nhận xét bảng 3.1 và biểu đồ 3.1:
Trong tổng số 1788 bệnh nhân bị HCTDNĐ/ÂĐ đến xét nghiệm tại khoa Vi sinh Bệnh viện Da Liễu Trung ƣơng trong thời gian từ tháng 1/2017 đến tháng 10/2017 có 140 bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn lậu, chiếm 7,83%.
Bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo âm đạo đến khám nhiều nhất vào tháng 8. Tháng có số bệnh nhân đến khám ít nhất là tháng 01/2017.
Tƣ̀ tháng 1 đến tháng 10 năm 2017 có tổng số 140 bê ̣nh nhân dƣơng tính với bê ̣nh lâ ̣u trên tổng số 1788 bê ̣nh nhân có hô ̣i chƣ́ng tiết di ̣ch niê ̣u đa ̣o / âm đa ̣o đến khám và điều trị tại Bệnh viện Da liễu Trung ƣơng. Trên thƣ̣c tế, số ngƣời mắc bê ̣nh lâ ̣u trong cô ̣ng đồng cao hơn rất nhiều lần . Nguyên nhân là do nhiều bê ̣nh nhân quan niệm đây là bệnh khó nói, mặc cảm nên họ khơng đến khám chƣ̃a bê ̣nh ta ̣i các đơn vi ̣ y tế nhà nƣớc , họ thƣờng đi khám và điều trị ở các phòng khám tƣ thậm chí có nhiều ngƣời mua th́c ta ̣i quầy thuốc để tự điều trị .
Theo báo cáo thƣờng quy tại BVDLTW ƣớc tính mỗi năm có khoảng 400 bệnh nhân lậu đến khám và điều trị.
Theo Nguyễn Hữu Sáu nghiên cứu tại BVDLTW từ năm 2006 đến năm 2010 thấy có 1946 bệnh nhân lậu trên 20.260 bệnh nhân khám các bệnh LTQĐTD, chiếm tỉ lệ 9,6%. Nguyễn Đình Hà nghiên cứu từ 11/2006 đến 4/2007 tại BVDLTW thấy số bệnh nhân lậu trong tổng số bệnh nhân mắc bệnh LTQĐTD chiếm 11,08% . Nguyễn Hồng Hinh nghiên cứu từ 1/2001 đến 12/2003 thấy tỷ lệ mắc lậu trong tổng số bệnh LTQĐTD là 10,16%.
Trên thế giới, tình hình mắc bệnh lậu cũng tuỳ theo từng khu vực, từng nƣớc mà tỷ lệ mắc bệnh lậu khác nhau. Theo Creighton tại khoa hoa liễu Bệnh viện Hoàng Gia Anh năm 2003, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu khá cao 18,8% [44]. Ở khu vực châu Á - Thái Bình Dƣơng theo ƣớc tính của WHO tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 14%. Nghiên cứu của Adaskevich, trƣờng Đại học Y Belarus cho thấy tỷ lệ bị bệnh lậu ở bệnh nhân mắc bệnh LTQĐTD là 18%. Ở 1 số nƣớc khác tỷ lệ bệnh lậu thấp hơn nhiều. Nghiên cứu của Van der Pol tại Uganda cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đây là 3,4%.
Tỷ lệ phát hiện bệnh lậu phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trƣớc hết phụ thuộc vào sự hiểu biết của ngƣời dân về bệnh và cách phòng tránh bệnh lậu, về lối sống và hành vi tình dục an tồn. Một yếu tố cũng rất quan trọng trong việc phát hiện bệnh là kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên xét nghiệm, chất lƣợng của phòng xét nghiệm.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, bệnh nhân có HCTDND /AD trong các tháng tƣơng đối đồng đều. Tháng 1 có số bệnh nhân TDNĐ đi khám ít nhất đồng thời số bệnh nhân lậu gặp cũng ít. Tháng 10 có 405 bệnh nhân TDNĐ đi khám không phải là số cao nhất, tháng 8 có số bệnh nhân TDNĐ đi khám nhiều nhất 472 bệnh nhân. Tuy nhiên, số bệnh nhân lậu gặp ở tháng 10 lại chiếm tỉ lệ cao nhất, sau đó là tháng 9.
So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với tác giả Đào Hữu Ghi thấy tƣơng tự. Theo tác giả này, tháng 7 có số bệnh nhân lậu đến khám nhiều nhất chiếm tỉ lệ 12,7% sau đó là tháng 10 (9,8%). Đây là những tháng không liên quan đến ngày nghỉ lễ.
Nhƣ vậy, có thể thấy bệnh lậu có thể gặp ở bất cứ thời điểm nào trong năm không liên quan đến ngày nghỉ lễ hay thời tiết khí hậu.
3.1.2. Mơ ̣t sớ yếu tố liên quan tới tỷ lệ nhiễm: 3.1.2.1. Phân bố theo giới tính 3.1.2.1. Phân bố theo giới tính
Bảng 3.2. Phân bố bệnh nhân theo giới
Giới tính n Tỷ lệ %
Nữ 656 36,68
Nam 1132 63,62
Tổng số 1788 100
Nhận xét bảng 3.2:
Số lƣợng bệnh nhân nam giới có hội chứng tiết dịch niệu đạo đên khám chiếm tỷ lệ cao (63,62%) vì những triệu chứng lâm sàng ở nam dễ tự phát hiện. Ở
bệnh nhân nữ, triệu chứng lâm sàng tiến triển chậm, không rõ ràng nên tỷ lệ thấp hơn (36,68%).
Bảng 3.3. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo giới
Giới tính Âm tính Dƣơng tính Tổng số
Nữ 635 (96,79%) 21 (3,21%) 656 (100%) Nam 1013 (89,49%) 119 (10,51%) 1132 (100%) Tổng số 1648 (92,17%) 140 (7,83%) 1788 (100%)
Nhận xét bảng 3.3:
Tỷ lệ phát hiện đƣợc vi khuẩn lậu ở nam giới (10,51%) cao hơn ở nữ giới (3,21%).
Theo Lê Văn Hƣng nghiên cứu tại Viện Da liễu Quốc gia năm 2003, tỷ lệ bệnh lậu nam là 21,75%; nữ là 7,57%. Theo Nguyễn Hữu Sáu (2006-2010), trong các bệnh nhân bị lậu, nam giới chiếm 64,9%, nữ giới chỉ chiếm 35,1%. Đỗ Ngọc Hoài nghiên cứu tại Bệnh viên Da liễu Trung ƣơng năm 2006 – 2010 cho thấy nam chiếm 15,72%; nữ chiếm 9,36%. Theo tác giả Backare tại Nigeria, trong các bệnh nhân lậu, nam chiếm 75,2%, nữ chiếm 24,8% .
Theo nhƣ nghiên cứu của chúng tơi thì tỷ lệ bệnh nhân lậu là nữ thấp hơn so với các nghiên cứu trƣớc đó.
Tuy nhiên cũng giống nhƣ các nghiên cứu trƣớc tỷ lệ nam giới mắc bệnh lậu cao hơn nhiều so với nữ giới.
Khác biệt có thể do phụ nữ ngày càng ý thức đƣợc sức khỏe sinh sản nên họ đã khám định kỳ ở các trung tâm y tế , phòng khám sản phụ khoa và các trung tâm kế hoạch hóa gia đình.
Một vấn đề cần đề cập đến ở đây là nam giới bị bệnh LTQĐTD nói chung và nhiễm vi khuẩn lậu nói riêng phần lớn đều có tỷ lệ cao hơn nữ giới. Phải chăng do xã hội ngày nay các chuẩn mực đạo đức khơng đƣợc đặt lên hàng đầu, vì thế khi đàn ơng đa số nắm kinh tế trong gia đình, họ sẵn sàng phản bội hơn nhân để kiếm tìm khối cảm mới lạ.
Song song với đó là internet đang đƣợc phổ biến rộng rãi và mặt trái của nó là dễ dàng phát tán những văn hóa phẩm đồi trụy, những thanh thiếu niên khi tiếp cận với những văn hóa phẩm này dễ bị sa ngã. Trong nghiên cứu của tôi có một bệnh nhân là bé gái 5 tuổi bị lạm dụng tình dục, chúng tơi đã lấy bệnh phẩm ở âm đạo đẻ làm xét nghiệm kết quả dƣơng tính với vi khuẩn lậu. Đau đớn hơn là em bị