Chƣơng II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dƣơng
Các bước tiến hành tách ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dương bằng kit tách ADN hệ gen của hãng Qiagen được tiến hành như sau:
5 ml dung dịch ni đƣợc ly tâm ở 7500 vịng/phút trong 10 phút để thu lấy tủa tế bào. Sau đó, tủa đƣợc bổ sung 180 μl dung dịch lysozyme 20 mg/ml trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; EDTA 2 mM; Trixton 1,2%. Hỗn hợp đƣợc ủ 30 phút ở 370C rồi đƣợc thêm tiếp 20 μl proteinase K và 200 μl đệm AL. Hỗn hợp này đƣợc trộn đều và ủ ở 560C trong 30 phút sau đó để ở 950C trong 15 phút. Ở bƣớc tiếp theo, hỗn hợp phản ứng đƣợc bổ sung 200 μl ethanol 100% vào mẫu, trộn đều, sau đó đem ly tâm nhẹ để thu hết dịch bám trên thành và nắp ống. Hỗn hợp sau đó đƣợc chuyển lên cột QIAamp Spin rồi ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Sau khi dịch qua cột đƣợc loại bỏ, bổ sung tiếp 500 μl đệm AW1 vào cột. Cột đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ dịch qua cột. 500 μl đệm AW2 đƣợc thêm vào và hỗn hợp phản ứng đƣợc đem ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 3 phút. Dịch qua cột tiếp tục đƣợc loại bỏ và ly tâm lại một lần nữa để loại hoàn toàn đệm. Cuối cùng, cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml mới. 200 μl đệm AE đƣợc thêm vào và ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch qua cột chứa ADN đƣợc thu lấy và bảo quản ở -200C.