Chƣơng II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.11. Nuôi cấy tạo bào tử
Các khuẩn lạc tế bào B. subtilis đƣợc lựa chọn nuôi trong 5 ml môi trƣờng LB ở 37oC trong 5-6 giờ. Sau đó, 3 ml mơi trƣờng ni cấy đƣợc pha lỗng trong 50 ml môi trƣờng LB mới. Tiếp theo, 2 ml dịch pha loãng đƣợc cấy trải lên đĩa thạch DSM (Difco Sporulation medium) và ủ ở 37o
C trong 60 giờ để tạo bào tử theo phƣơng pháp của Nicholson và Setlow [26]. Sau khoảng thời gian này, vi khuẩn bị kích thích và hình thành trạng thái nghỉ của nó là bào tử. Một cách khác để tạo bào tử với số lƣợng lớn là 5ml dịch nuôi cấy đƣợc bổ sung vào 1,2 lit dung dịch môi trƣờng DSM và lắc liên tục trong 48 giờ trong nồi lên men. Sau đó, bào tử đƣợc thu lại, xử lí bằng lysozyme để loại bỏ lớp nhày bao ngoài bào tử rồi rửa sạch bằng KCl 1M và NaCl 1M. Phần trăm bào tử tạo thành sẽ đƣợc đánh giá bằng cách soi dƣới kính hiển vi điện tử. Sau đó, các mẫu bào tử đƣợc chia nhỏ vào ống eppendorf sạch chuẩn bị cho bƣớc thí nghiệm sau.
Thu dịch chiết protein áo bào tử
Với mỗi ống bào tử thu đƣợc, 40 μl dung dịch tách chiết (extraction buffer) đƣợc bổ sung vào. Thành phần dung dịch tách chiết nhƣ sau:
- Tris-HCl 0,5M pH 6,8 : 1 ml
- SDS 10% : 1 ml
- DTT (β-mercaptoethanol) 1M : 0,5 ml - H2O khử trùng vừa đủ 10 ml.
Sau khi bổ sung dung dịch tách chiết, các ống đƣợc trộn đều và ủ ở 95oC trong 15 phút (sau 5 phút mỗi ống đƣợc lấy ra và lắc mạnh). Cuối cùng, các ống đƣợc ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu lại dịch nổi để kiểm tra sự có mặt của protein