Chƣơng II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.16. Phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc (Reverse passive latex agglutination)
agglutination)
Trong phương pháp này, bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl được sử dụng để làm giá thể cho phản ứng ngưng kết. Các bước của phương pháp ngưng kết thụ động ngược được tiến hành như sau:
Trên các giếng của đĩa ELISA 96 giếng lần lƣợt bổ sung 10µl có chứa 108
bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl và 50µl dịch chứa WSSV. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn kỹ bằng pippete và đƣợc ủ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 4 tiếng, đĩa phản ứng đƣợc lấy ra quan sát phản ứng ngƣng kết.
2.2.17. Định lƣợng số bản copies của WSSV bằng kỹ thuật Real-time PCR
Nguyên tắc: giống nhƣ kỹ thuật PCR thông thƣờng, kỹ thuật Real-time PCR
cũng dựa trên khả năng nhân bản một trình tự ADN đích khi có mặt cặp mồi đặc hiệu của enzyme ADN polymerase. Tuy nhiên, khác với kỹ thuật PCR thông thƣờng, Realtime PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy các sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra do trong hỗn hợp có bổ sung thêm chất phát tín hiệu. Chất phát tín hiệu này khi liên kết với sản phẩm PCR sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và đƣợc bộ phận phát hiện huỳnh quang của máy PCR thu nhận. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh lƣợng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Chính vì vậy, kỹ thuật Realtime PCR có đọ chính xác và độ nhạy rất cao, tiết kiệm thời gian. Hơn nữa, kỹ thuật này còn giúp giảm nguy cơ ngoại nhiễm và các thao tác sau phản ứng khuếch đại.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật Real-time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá nồng độ virus mà phƣơng pháp ngƣng kết thụ động có thể phát hiện ra đƣợc. Chất phát huỳnh quang đƣợc sử dụng trong phản ứng là SYBR Green I, có khả năng liên kết với ADN mạch đơi và phát tín hiệu huỳnh quang rất mạnh. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System.