1.4.Tách chiết, phân lập alkaloid từ cây C harringtonia
2.2. Phần thực nghiệm
2.2.6. Xác định hàm lƣợng alkaloid bằng sắc ký HPLC
a) Khảo điều kiện phân tích thích hợp cho máy HPLC
Thiết bị HPLC đƣợc sử dụng cho nghiên cứu này đƣợc cung cấp bởi hãng Shimadzu (Nhật Bản) với detector PDA SPD-M10Avp; cột Cadenza C18 250*46mm, kích thƣớc hạt 3µm.
Thể tích bơm mẫu là 20 µL, nhiệt độ lò là 30o
C, tốc độ dòng là 1.0mL/phút. Pha động là hỗn hợp dung môi nƣớc và acetonitrile. Hai chƣơng trình gradient dung mơi đã đƣợc khảo sát để lựa chọn chƣơng trình sắc ký phù hợp cho hiệu quả tách cephalotaxine và homoharringtonine tốt nhất.
Ở chƣơng trình gradient 1, pha động bắt đầu với 0% acetonitrile, thành phần acetonitrile tăng dần tuyến tính tới khi đạt 30% ở phút thứ 20. Sau đó acetonitrile đƣợc tăng dần đều tới 100% ở phút thứ 30 và giữ ngun khơng đổi trong vịng 10 phút. Sau đó thành phần acetonitrile giảm nhanh xuống 0% trong 10 phút và giữ nguyên tỉ lệ đó tới phút thứ 55, là lúc kết thúc quy trình phân tích.
Ở chƣơng trình gradient 2, thành phần acetonitrile tăng tuyến tính từ 0% đến 30% trong vòng 35 phút đầu tiên. Tiếp theo, acetonitrile đƣợc tăng lên tới 100%.
Bảng 2.3: Chƣơng trình sắc ký gradient 1 Thời Thời gian (phút) CH3CN/H2O (v/v)
Thời gian lƣu (phút) Sự khác biệt giữa thời gian
lƣu của hai chất (phút) Cephalotaxine homoharringtonine 0.01 0/1 13.406 20.954 7.548 20.00 0.3/0.7 30.00 1/0 40.00 1/0 50.00 0/1 55.00 0/1 Bảng 2.4: Chƣơng trình sắc ký gradient 2 Thời gian (phút) CH3CN/H2O (v/v)
Thời gian lƣu (phút) Sự khác biệt giữa thời gian lƣu của hai chất
(phút) Cephalotaxine homoharringtonine 0.01 0/1 18.253 33.849 15.596 35.00 0.3/0.7 45.00 1/0 50.00 1/0 55.00 0/1 60.00 0/1
trong vịng 10 phút và giữ ngun khơng đổi cho đến phút thứ 45. Từ phút thứ 46 đến 50, thành phần acetonitrile giảm nhanh xuống 0% và giữ nguyên không đổi đến phút thứ 55, là lúc kết thúc phân tích.
Các thơng số của chƣơng trình sắc ký và thời gian lƣu của chất chuẩn đƣợc thể hiện ở bảng 5 và bảng 6 dƣới đây và trên hình 3.2 (xem phần thảo luận).
Sắc ký đồ HPLC của cephalotaxine và homoharringtonine thu đƣợc từ hai chƣơng trình dung mơi gradient đƣợc trình bày ở hình 2.1 và hình 2.2 .
H nh 2.1: Sắc ký đồ HPLC của cephalotaxine và homoharringtonine đối với
chƣơng trình gradient dung mơi 1
H nh 2.2: Sắc ký đồ HPLC của cephalotaxine và homoharringtonine đối với
b) Định lƣợng các alkaloid trong cây C. harringtonia Xây dựng đƣờng chuẩn homoharringtonine
Đƣờng chuẩn homoharringtonine đƣợc xây dựng từ 5 nồng độ khác nhau lần lƣợt là: 50, 83, 238, 349, 445 ppm. Đƣờng chuẩn mơ tả sự phụ thuộc của diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ của chất chuẩn homoharringtonine.
Hình 2.3: Đƣờng chuẩn HPLC của homoharringtonine
Bằng cách áp dụng phƣơng trình đƣờng chuẩn, y = 4960,3x – 29381, ta có thể tính đƣợc nồng độ của homoharringtonine có trong mẫu chiết.
Đƣờng chuẩn của cephalotaxine
Hình 2.4: Đƣờng chuẩn HPLC của cephalotaxine
y = 7408.7x - 27742 R² = 0.9988 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 0 100 200 300 400 500 600 Diện tích pic Nồng độ cephalotaxine (ppm)
Đƣờng chuẩn cephalotaxin đƣợc xây dựng từ 5 nồng độ khác nhau lần lƣợt là: 60, 90, 148, 289, 552 ppm. Đƣờng chuẩn mơ tả sự phụ thuộc của diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ của chất chuẩn cephalotaxine.
Bằng cách áp dụng phƣơng trình đƣờng chuẩn, y = 7408,7x – 27742, ta có thể tính đƣợc nồng độ của cephalotaxine trong mẫu chiết.
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Để thực hiện mục tiêu đề ra, trong cơng trình này đã thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
1. Thu thập và xử lý mẫu cây C. harringtonia từ Nhật Bản;
2. Xây dựng quy trình chiết các hợp chất alkaloid thơ có từ cành nhánh và lá cây C. harringtonia;
3. Phân tích bằng sắc ký lớp m ng (TLC) để định tính thành phần các phần chiết và tìm các hệ dung mơi thích hợp cho việc phân lập bằng sắc ký cột;
3. Phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất thành phần chính bằng phƣơng pháp sắc ký l ng hiệu năng cao (HPLC);
4. Xác định hàm lƣợng Cephalotaxine và Homoharringtonine trong cây C. harringtonia bằng phƣơng pháp sắc ký l ng hiệu năng cao.