Ngƣời ta có thể sử dụng nhiều loại dung môi để chiết alkaloid từ các loại cây cephalotaxus. Dung môi lựa chọn phải đáp ứng các tiêu chí: hịa tan tốt các
alkaloid; không tham gia phản ứng với các alkaloid có trong mẫu chiết; ít tạo nhũ trong q trình chiết. Theo tham khảo ở các tài liệu nghiên cứu đi trƣớc, methanol là dung mơi có tốt nhất với hàm lƣợng alkaloid chiết đƣợc cao nhất [29].
Bột mịn khô nghiền từ lá và cành nh cây C. harringtonia đƣợc ngâm chiết trong dung môi methanol (tỉ lệ khối lƣợng bột: methanol = 1: 4) ở nhiệt độ phịng, có khuấy cơ học vận tốc 200 vịng/phút. Q trình này đƣợc lặp lại nhiều lần để đảm bảo thu đƣợc hàm lƣợng alkaloid tối đa.
Bột nguyên liệu từ cành nh và lá cây của C. harringtonia chứa nhiều lipit, nên trong q trình chiết trong mơi trƣờng axit, việc lắc mạnh dẫn đến hiện tƣợng tạo nhũ, gây cản trở cho quá trình tách pha. Để xử lý hiện tƣợng này, sau khi axit hóa phần dịch chiết trong methanol với dung dịch axit tartaric 6%, một lƣợng nƣớc cất xấp xỉ ½ thể tích dịch chiết trong mơi trƣờng axit đƣợc thêm vào. Sau đó, dịch chiết đƣợc chiết nhiều lần với clorofom. Lặp lại quá trình chiết với clorofom nhiều lần, mỗi lần thêm clorofom theo tỉ lệ ½ về thể tích. Chú ý, hỗn hợp đƣợc lắc nhẹ nhàng và đều đặn theo quỹ đạo tròn để tránh tối đa việc tạo nhũ. Đối với khoảng 50g mẫu nguyên liệu đầu, khoảng 1 lít dung mơi methanol đƣợc sử dụng để ngâm
chiết, 300ml clorofom đƣợc sử dụng trong giai đoạn chiết trong môi trƣờng axit, và 300ml clorofom đƣợc sử dụng trong giai đoạn chiết trong môi trƣờng kiềm.
3.3 Tách và phân lập alkaloid bằng phƣơng pháp chiết axit-bazơ
Dịch chiết methanol chứa nhiều tạp chất, bao gồm các hợp chất hữu cơ (các alkaloid, lipid và các tecpen...). Để phân tách các alkaloid kh i lipid và tecpen cần phải sử dụng kỹ thuật tách axit –bazơ. Bản chất của kỹ thuật này là dùng hỗn hợp dung mơi thích hợp trong mơi trƣờng với pH khác nhau để tách alkaloid. Quá trình tách và phân lập alkaloid đƣợc tiến hành nối tiếp nhau.
3.3.1 Loại bỏ thành phần không phải alkaloid bằng dung dịch axit tartric
Việc tách các alkaloid kh i các chất lipid và tecpen đƣợc tiến hành bằng hỗn hợp dung mơi CHCl3 và dung dịch nƣớc của axit tartric. Vì các alkaloid có ngun tử N (amin) giàu electron, chúng có thể bị proton hóa trong mơi trƣờng axit theo phƣơng trình sau:
Các hợp chất alkaloid có tính kiềm, sau khi bị proton hóa, sẽ tan vào pha nƣớc, trong khi các hợp chất không phân cực (terpenoid, sáp, lipid,…) sẽ tan trong pha CHCl3. Trong nghiên cứu này, dung dịch axit tartaric 6% đƣợc sử dụng để tạo môi trƣờng axit (pH~2-3). Lý do dùng axit tartric mà không phải là các axit vơ cơ (HCl, H2SO4…) là vì nó đủ mạnh (pKa = 3,07) để tạo muối amoni mà không làm
thay đổi cấu trúc của các alkaloid cần tách. Các axit vơ cơ mạnh proton hóa nhóm amino, đồng thời sẽ thủy phân nhóm este của các alkaloid quý hiếm, khó tổng hợp nhƣ homoharringtonine:
Sau khi lắc đều mẫu alkaloid thô với hỗn hợp dung môi chloroform và nƣớc, để yên cho phân lớp, pha clorofom có tỷ trọng cao hơn, lắng xuống dƣới, đƣợc loại b , thu đƣợc pha nƣớc chứa muốn amoni của các alkaloid. Cần thấy rằng, quá trình chiết axit đƣợc tiến hành lặp lại vài lần để tận thu alkaloid. Màu của hai pha clorofom và nƣớc sau mỗi lần chiết trở nên nhạt hơn do thành phần chất tan còn lại
+
giảm dần. Để biết alkaloid đã đƣợc chiết triệt để kh i pha clorofom hay chƣa, đã dùng thuốc thử Dragendorff để kiểm tra.
3.3.2 Thu hồi alkaloid từ pha nƣớc bằng dung dịch amoniac
Sau khi loại b lớp dịch chiết clorofom, phần dung dịch chứa alkaloid trong nƣớc đƣợc chiết bằng hỗn hợp dung dịch kiềm và clorofom. Bƣớc 1 của quá trình chiết là phản ứng của muối amoni bậc 4 với kiềm để giải phóng các phân tử alkaloid trung hịa theo phƣơng trình:
R3NH + OH- H2O + R3N
Trong nghiên cứu này, đã sử dụng tác nhân kiềm là dung dịch ammoniac (pH ~ 9-10). Ở đây chỉ dùng dung dịch NH4OH mà không dùng các tác nhân kiềm
mạnh (KOH, NaOH…). Lý do là dung dịch ammoniac đủ mạnh để trung hòa axit, giải phóng và bảo tồn cấu trúc alkaloid tự do. Các tác nhân kiềm mạnh sẽ dẫn đến phản ứng không mong muốn, là thủy phân các alkaloid quý có cấu trúc este, nhƣ homoharringtonine, theo phƣơng trình phản ứng:
Bƣớc 2 của quá trình chiết bazơ là chiết các alkaloid tự do bằng dung môi clorofom. Hỗn hợp alkaloid thô đƣợc thu hồi sau khi cất đuổi hồn tồn dung mơi ở áp suất thấp và nhiệt độ khoảng 30°C.
Kết quả nghiên cứu cho thấy với quy trình chiết alkaloid trên đây, hiệu suất tách alkaloid thô đạt đƣợc từ 0,55-0,66%. Hỗn hợp alkaloid thô đƣợc bảo quản ở điều kiện 4-10°C để tránh sự phân hủy.
3.4 Thuốc thử Dragendorff hiển thị sắc ký bản mỏng
Thuốc thử Dragendorff là kali bismuth (III) tetraiodide, thƣờng đƣợc sử dụng làm chất hiển thị TLC trong các nghiên cứu về alkaloid [18]. Sau khi đƣợc điều chế theo quy trình mơ tả tại mục 2.2.1, thuốc thử Dragendroff có tính axit mạnh, đƣợc bảo quản ở 10°C. Trong phản ứng hiển thị màu, anion bismuth (III) tetraiodide BiI4- phản ứng với các alkaloid bị proton hóa, theo phản ứng sau [12]:
Alkaloid+-H + BiI4- → (alkaloid+-H)n(BiI4-)n
Phản ứng này tạo phức bền kết tủa, thƣờng có màu đ cam. Màu của phức chất cũng thay đổi từ vàng/cam, đ /cam, cam/hồng tùy thuộc vào nhóm chất alkaloid.
Sau khoảng 7 ngày, một số kết tủa đen xuất hiện trong dung dịch. Tuy nhiên, hiện tƣợng này không làm giảm khả năng hiển thị màu của thuốc thử.
3.5 Khảo sát sơ bộ thành phần alkaloid th bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
Với mục đích tách phân đoạn giàu cephalotaxine hiệu quả cao từ dịch chiết methanol bằng phƣơng pháp sắc ký với chất hấp phụ silicagel, đã tiến hành khảo sát tìm hệ dung mơi thích hợp nhất có thể. Kết quả thực nghiệm đƣợc trình bày tại Bảng 3, mục 2.2.4. Theo kết quả trong bảng 2.1, hỗn hợp CHCl3 : MeOH = 9:1, là hệ dung môi phù hợp nhất. Các hệ dung môi 3 cấu tử luôn tạo thành một vệt chất dài, đậm, không xác định đƣợc phần có Rf tƣơng đƣơng với Rf của chất chuẩn cephalotaxine. Trong khi đó, hệ dung mơi CHCl3 : MeOH = 9:1 cho 2 vệt chất đƣợc tách rời nhau. Vệt chất có Rf cao hơn, tƣơng đƣơng với Rf của chất chuẩn
cephalotaxine. Do đó, CHCl3 : MeOH = 9:1, đƣợc lựa chọn làm dung môi rửa giải trên sắc ký cột bằng silicagel.
Đồng thời, đã khảo sát tìm hệ dung mơi thích hợp để tách alkaloid bằng chất hấp phụ oxit nhôm, kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 2.2 (xem thực nghiệm, mục 2.2.4). Kết quả ở Bảng 4 cho thấy, các hệ dung môi CHCl3 : MeOH = 97:3 và CHCl3 : MeOH : acetonitrile = 97 :2 :1, là các hệ dung môi phù hợp để tách các chất alkaloid bằng chất hấp phụ nhôm oxit. Hệ dung môi 3 cấu tử CHCl3 : MeOH : acetonitrile = 97 :2 :1 cho vệt chất trịn hơn hệ dung mơi CHCl3 : MeOH = 97:3. Vệt chất chuẩn và vệt chất có Rf cao nhất phân tách đƣợc trong mẫu alkaloid thơ có Rf bằng nhau. Các vệt chất còn lại của mẫu alkaloid thơ cũng có Rf đƣợc tách rõ ràng, cách xa kh i đƣờng nền. Hệ dung môi này đƣợc sử dụng làm dung môi rửa giải đối với sắc ký cột bằng nhôm oxit.
Các kết quả khảo sát cũng cho thấy sử dụng nhôm oxit cho hiệu quả tách tốt hơn silicagel, các vệt chất tròn hơn với sự khác biệt về Rf rõ ràng hơn. Điều này có thể giải thích đƣợc. Silicagel có tính axit mạnh hơn nhơm oxyt, do đó khi sử dụng
làm chất hấp phụ có thể tạo liên kết với alkaloid, là những hợp chất có tính ba sơ. Theo Gary Witman [9], chấp hấp phụ nhơm oxit sở hữu cả các tâm mang tính axit và basơ Lewis yếu. Nó có thể hấp phụ các alkaloid chiết xuất từ thực vật thơng qua các chuỗi liên kết Al-O. Hoạt tính hấp phụ của nhơm oxit có thể thay đổi theo nhiệt độ và độ hidrat hóa. Trong nghiên cứu này, trƣớc khi sử dụng, nhơm oxit cần đƣợc hoạt hóa ở 150°C trong vịng 24 giờ.
3.6 Phân lập các alkaloid bằng sắc ký cột 3.6.1.Quy tr nh A ( xem sơ đồ 2.2) 3.6.1.Quy tr nh A ( xem sơ đồ 2.2)
Trong quy trình A, alkaloid đƣợc phân tách qua hai giai đoạn: giai đoạn 1 sử dụng sắc ký cột silicagel, giai đoạn 2 sử dụng sắc ký cột nhôm oxit.
Khi rửa giải cột sắc ký silicagel bằng hệ dung môi CHCl3:MeOH = 9:1, đã thu làm 39 phân đoạn. Sau khi cất loại dung môi, từng phân đoạn chạy sắc ký bản m ng silicagel, các phân đoạn 1 đến 32 đƣợc rửa giải ra trƣớc có vệt dài, khơng tách kh i nhau, do chứa nhiều tạp chất đƣợc gom thành nhóm phân đoạn A1. Các
phân đoạn 33 đến 39 có vệt trịn, với Rf giống nhau đƣợc gom thành nhóm phân đoạn A2. Sau khi cất loại dung mơi, chạy sắc ký bản m ng silicagel có Rf (Rf = 0,19), bằng Rf của cephalotaxine, là phân đoạn giàu cephalotaxine.
Để thu cephalotaxine có độ tinh khiết cao hơn, phân đoạn A2 đƣợc tiếp tục chạy sắc ký nhôm oxit, rửa giải bằng hỗn hợp CHCl3:MeOH = 97:3 và thu làm 43 phân đoạn. Sau khi cất loại dung môi, từng phân đƣợc chạy sắc ký bản m ng silicagel. Các phân đoạn 1 đến 11 tách tốt, có Rf giống nhau, đƣợc gom thành nhóm phân đoạn A2.1. Các phân đoạn từ 13 đến 43 tách kém, không xác định đƣợc Rf, đƣợc gom thành nhóm phân đoạn A2.2. Sau khi tách loại dung mơi, chạy sắc ký bản m ng (Rf = 0,84) trùng khớp với Rf của cephalotaxine. Nhƣ vậy phân đoạn
A2.1 là cephalotaxine.
Xác định bằng sắc ký HPLC cho thấy hàm lƣợng cephalotaxine là 4,85%. Hàm lƣợng thấp có thể do quy trình A gồm 2 giai đoạn (chạy silicagel sau đó đến
cột oxit nhơm), nên chất có thể bị thất thoát trong quá trình rửa giải. Vì vậy, đã nghiên cứu xây dựng quy trình 1 giai đoạn.
3.6.2.Quy tr nh B
Sử dụng sắc ký bản mỏng điều chế (xem sơ đồ 2.3)
Sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit (xem phần thực nghiệm) cho hiệu quả tách khá tốt. Các vệt chất xuất hiện ở vị trí cách xa nhau (ΔRf = 0,3). Tuy nhiên, nhƣợc điểm của kỹ thuật này là sức tải của bản m ng (capacity) thấp, nên khi chạy một lƣợng lớn hỗn hợp alkaloid trên bản m ng thì các vệt chất phát triển chậm và khơng đều nhau (xem hình 3.1). Vì thế, phần hỗn hợp alkaloid tách đƣợc còn chứa nhiều tạp chất không mong muốn.
H nh 3.1: Phân tách alkaloid trên sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit
Kết luận sơ bộ có thể rút ra là, chỉ sử dụng sắc ký bản m ng điều chế khi cần tách một lƣợng alkaloid rất nh (khoảng một vài mg). Đối với lƣợng alkaloid lớn, sử dụng sắc ký cột sẽ cho hiệu suất cao hơn.
Sử dụng sắc ký cột nh m oxit (xem sơ đồ 2.4)
Alkaloid thô đƣợc tách trên cột sắc ký nhôm oxit, hệ dung môi gradient nhƣ sau: 120ml CHCl3 : MeOH = 97 : 3; 150ml CHCl3 : MeOH = 95: 5; 40 ml MeOH (xem phần thực nghiệm).
Nhóm phân đoạn B1 gồm các phân đoạn có Rf = 0,8, tƣơng đƣơng với Rf của cephalotaxine. Kết quả xác định hàm lƣợng bằng sắc ký HPLC cho thấy, hàm
lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine thu đƣợc lần lƣợt là 10,77 và 21,92%. Tuy nhiên, quy trình này vẫn thu đƣợc cephalotaxine và homoharringtonine có độ tinh khiết chƣa cao (< 90%). Vì vậy, đã tiếp tục nghiên cứu tìm phƣơng pháp tách để có sản phẩm với độ tinh khiết cao hơn.
3.6.3.Quy tr nh C (xem sơ đồ 2.5)
Hỗn hợp alkaloid thô khi hịa tan trong dung mơi MeOH, dung dịch ln có màu vàng nâu, là do có chứa chất màu vơ cơ hoặc hữu cơ. Để loại b chất màu đã dùng than hoạt tính. Cho than hoạt tính vào dung dịch, khuấy trong khoảng 45 phút. Sau khi lọc b than hoạt tính thấy dung dịch có màu nhạt hơn, chứng t các tạp chất mang màu đã đƣợc hấp phụ trên than hoạt tính. Sau khi đƣợc làm sạch bằng than hoạt tính, dung dịch đƣợc kết tinh lại bằng nƣớc đá, lọc hút, thu đƣợc tinh thể đem phân tích HPLC. Tổng hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine trong phân đoạn C2 là 31,51%, cao hơn nhiều so với tổng hàm lƣợng các chất tƣơng ứng trong mẫu alkaloid thô ban đầu (24,21%).
Tổng hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine trong phân đoạn C5 là 23,17%. Sau khi chiết lại với n-hexan, tổng hàm lƣợng các chất tƣơng ứng đã đƣợc làm giàu lên đến 74,80%. Các mẫu C2, C4, C5 đều có cùng tỉ lệ cep/tổng và tỉ lệ HHT/tổng nhƣ nhau. Sau khi xử lý với n-hexan, mẫu C6 có các tỉ lệ cep/tổng và tỉ lệ HHT/tổng tăng, cịn trong mẫu C7 các tỉ lệ đó giảm. Điều này cho thấy n-hexan có thể dùng để làm giàu cephalotaxine và homoharringtonine trong hỗn hợp dịch chiết.
3.6.4.Quy tr nh D (xem sơ đồ 2.6)
Qua 3 quy trình A, B, C khác nhau, kết hợp giữa sắc ký bản m ng điều chế và sắc ký cột điều chế, với chất hấp phụ silicagel và chất hấp phụ nhơm oxit đã trình bày ở trên, ta có thể thấy rằng:
- Quy trình A cho hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine rất thấp. Quy trình B và C cho hiệu suất tách tốt hơn và cho hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine cũng đều cao hơn.
-Nhôm oxit là chất hấp phụ tốt hơn silicagel khi phân lạp cephalotaxine và homoharringtonine bằng sắc ký cột.
-Than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất màu, có tác dụng làm sạch mẫu chiết alkaloid thơ, giúp cho q trình tách dễ dàng và các alkaloid thu đƣợc có độ tinh khiết cao hơn.
Tuy nhiên, trong các quy trình trên, phải dùng một lƣợng methanol nhất định để hòa tan alkaloid trƣớc khi nạp lên cột sắc ký, lƣợng metanol này có thể ảnh hƣởng, làm thay đổi gradien hỗn hợp dung mơi rửa giải, vì tỷ lệ metanol trong hỗn hợp rất nh (2%). Vì vậy, đã nghiên cứu phƣơng pháp loại b ảnh hƣởng này.
Trong quy trình D, trƣớc khi xử lý với than hoạt tính, mẫu alkaloid thơ M đã đƣợc chạy sắc ký bản m ng nhôm oxit với hệ dung môi CHCl3 : MeOH : acetonitrile = 97 :2 :1. Kết quả cho 3 vệt tròn, đậm với Rf tƣơng ứng là 0,75 ; 0,61 ; 0,25 (xem hình 10a). Hai vệt sau có Rf tƣơng đƣơng với Rf của cephalotaxine và homoharringtonine chuẩn, lần lƣợt là 0,61 và 0,25. Sau khi mẫu M đƣợc xử lý với than hoạt tính, sắc ký bản m ng hiển thị 2 vệt có Rf tƣơng đƣơng với 2 vệt chất chuẩn (xem hình 10b). Điều này cho thấy, mẫu sau khi xử lý bằng than hoạt tính đã cho alkaloid sạch hơn, có Rf cao hơn, gần với Rf của chất chuẩn cephalotaxine và homoharringtonine.
Để chạy sắc ký cột, alkaloid thơ đƣợc hịa tan trong dung mơi MeOH, trộn đều với nhơm oxit, sau đó loại hết hồn tồn dung mơi trƣớc khi nạp lên cột sắc ký để loại b ảnh hƣởng của lƣợng methanol này lên gradien hỗn hợp dung môi rửa giải.
Sau khi chạy qua sắc ký cột, dịch chiết alkaloid đƣợc làm 22 phân đoạn. Các phân đoạn 1 đến 8 có Rf giống nhau, đƣợc gom thành nhóm O1, các phân đoạn từ 9 đến 22 có Rf giống nhau, đƣợc gom thành nhóm O2. Theo kết quả sắc ký bản m ng trên hình 10(b), cephalotaxine và homoharringtonine đều có mặt trong nhóm phân đoạn O1. Trong khi đó nhóm phân đoạn O2 chỉ chứa homoharringtonine. Từ đó ta có thể khẳng định, than hoạt tính có tác dụng làm sạch, loại b một số alkaloid khơng mong muốn, làm đơn giản hóa và rút ngắn quá trình tách cephalotaxine và homoharringtonine.
(a) (b)
H nh 3.2. TLC của các mẫu dịch chiết alkaloid trên bản m ng nhôm oxit,
dung môi rửa giải CHCl3 : MeOH : acetonitrile = 97 :2 :1.
(a) từ trái qua phải: hỗn hợp chất chuẩn Cep và HHT; mẫu alkaloid thô; chất chuẩn Cep; mẫu alkaloid thô sau khi xử lý bằng than hoạt tính.
(b) từ trái qua phải: chất chuẩn Cep; nhóm phân đoạn O1; hỗn hợp chất
chuẩn Cep và HHT; nhóm phân đoạn O2; mẫu alkaloid thô O sau xử lý bằng than hoạt tính.
3.7 Phân tích thành phần alkaloid bằng phƣơng pháp HPLC
Để định lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine trong hỗn hợp alkaloid thô thu đƣợc một cách chính xác, đã tiến hành phân tích hỗn hợp alkaloid bằng