Hình 2.4 : Đƣờng chuẩn HPLC của cephalotaxine
H nh 3.1: Phân tách alkaloid trên sắc ký bả nm ng điều chế nhôm oxit
Kết luận sơ bộ có thể rút ra là, chỉ sử dụng sắc ký bản m ng điều chế khi cần tách một lƣợng alkaloid rất nh (khoảng một vài mg). Đối với lƣợng alkaloid lớn, sử dụng sắc ký cột sẽ cho hiệu suất cao hơn.
Sử dụng sắc ký cột nh m oxit (xem sơ đồ 2.4)
Alkaloid thô đƣợc tách trên cột sắc ký nhôm oxit, hệ dung môi gradient nhƣ sau: 120ml CHCl3 : MeOH = 97 : 3; 150ml CHCl3 : MeOH = 95: 5; 40 ml MeOH (xem phần thực nghiệm).
Nhóm phân đoạn B1 gồm các phân đoạn có Rf = 0,8, tƣơng đƣơng với Rf của cephalotaxine. Kết quả xác định hàm lƣợng bằng sắc ký HPLC cho thấy, hàm
lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine thu đƣợc lần lƣợt là 10,77 và 21,92%. Tuy nhiên, quy trình này vẫn thu đƣợc cephalotaxine và homoharringtonine có độ tinh khiết chƣa cao (< 90%). Vì vậy, đã tiếp tục nghiên cứu tìm phƣơng pháp tách để có sản phẩm với độ tinh khiết cao hơn.
3.6.3.Quy tr nh C (xem sơ đồ 2.5)
Hỗn hợp alkaloid thô khi hịa tan trong dung mơi MeOH, dung dịch ln có màu vàng nâu, là do có chứa chất màu vơ cơ hoặc hữu cơ. Để loại b chất màu đã dùng than hoạt tính. Cho than hoạt tính vào dung dịch, khuấy trong khoảng 45 phút. Sau khi lọc b than hoạt tính thấy dung dịch có màu nhạt hơn, chứng t các tạp chất mang màu đã đƣợc hấp phụ trên than hoạt tính. Sau khi đƣợc làm sạch bằng than hoạt tính, dung dịch đƣợc kết tinh lại bằng nƣớc đá, lọc hút, thu đƣợc tinh thể đem phân tích HPLC. Tổng hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine trong phân đoạn C2 là 31,51%, cao hơn nhiều so với tổng hàm lƣợng các chất tƣơng ứng trong mẫu alkaloid thô ban đầu (24,21%).
Tổng hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine trong phân đoạn C5 là 23,17%. Sau khi chiết lại với n-hexan, tổng hàm lƣợng các chất tƣơng ứng đã đƣợc làm giàu lên đến 74,80%. Các mẫu C2, C4, C5 đều có cùng tỉ lệ cep/tổng và tỉ lệ HHT/tổng nhƣ nhau. Sau khi xử lý với n-hexan, mẫu C6 có các tỉ lệ cep/tổng và tỉ lệ HHT/tổng tăng, còn trong mẫu C7 các tỉ lệ đó giảm. Điều này cho thấy n-hexan có thể dùng để làm giàu cephalotaxine và homoharringtonine trong hỗn hợp dịch chiết.
3.6.4.Quy tr nh D (xem sơ đồ 2.6)
Qua 3 quy trình A, B, C khác nhau, kết hợp giữa sắc ký bản m ng điều chế và sắc ký cột điều chế, với chất hấp phụ silicagel và chất hấp phụ nhơm oxit đã trình bày ở trên, ta có thể thấy rằng:
- Quy trình A cho hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine rất thấp. Quy trình B và C cho hiệu suất tách tốt hơn và cho hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine cũng đều cao hơn.
-Nhôm oxit là chất hấp phụ tốt hơn silicagel khi phân lạp cephalotaxine và homoharringtonine bằng sắc ký cột.
-Than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất màu, có tác dụng làm sạch mẫu chiết alkaloid thơ, giúp cho q trình tách dễ dàng và các alkaloid thu đƣợc có độ tinh khiết cao hơn.
Tuy nhiên, trong các quy trình trên, phải dùng một lƣợng methanol nhất định để hòa tan alkaloid trƣớc khi nạp lên cột sắc ký, lƣợng metanol này có thể ảnh hƣởng, làm thay đổi gradien hỗn hợp dung mơi rửa giải, vì tỷ lệ metanol trong hỗn hợp rất nh (2%). Vì vậy, đã nghiên cứu phƣơng pháp loại b ảnh hƣởng này.
Trong quy trình D, trƣớc khi xử lý với than hoạt tính, mẫu alkaloid thơ M đã đƣợc chạy sắc ký bản m ng nhôm oxit với hệ dung môi CHCl3 : MeOH : acetonitrile = 97 :2 :1. Kết quả cho 3 vệt tròn, đậm với Rf tƣơng ứng là 0,75 ; 0,61 ; 0,25 (xem hình 10a). Hai vệt sau có Rf tƣơng đƣơng với Rf của cephalotaxine và homoharringtonine chuẩn, lần lƣợt là 0,61 và 0,25. Sau khi mẫu M đƣợc xử lý với than hoạt tính, sắc ký bản m ng hiển thị 2 vệt có Rf tƣơng đƣơng với 2 vệt chất chuẩn (xem hình 10b). Điều này cho thấy, mẫu sau khi xử lý bằng than hoạt tính đã cho alkaloid sạch hơn, có Rf cao hơn, gần với Rf của chất chuẩn cephalotaxine và homoharringtonine.
Để chạy sắc ký cột, alkaloid thơ đƣợc hịa tan trong dung mơi MeOH, trộn đều với nhơm oxit, sau đó loại hết hồn tồn dung mơi trƣớc khi nạp lên cột sắc ký để loại b ảnh hƣởng của lƣợng methanol này lên gradien hỗn hợp dung môi rửa giải.
Sau khi chạy qua sắc ký cột, dịch chiết alkaloid đƣợc làm 22 phân đoạn. Các phân đoạn 1 đến 8 có Rf giống nhau, đƣợc gom thành nhóm O1, các phân đoạn từ 9 đến 22 có Rf giống nhau, đƣợc gom thành nhóm O2. Theo kết quả sắc ký bản m ng trên hình 10(b), cephalotaxine và homoharringtonine đều có mặt trong nhóm phân đoạn O1. Trong khi đó nhóm phân đoạn O2 chỉ chứa homoharringtonine. Từ đó ta có thể khẳng định, than hoạt tính có tác dụng làm sạch, loại b một số alkaloid khơng mong muốn, làm đơn giản hóa và rút ngắn quá trình tách cephalotaxine và homoharringtonine.
(a) (b)