CHCl3: Etylaxetat (1:1) Cephalotaxine Cặn chiết Alkaloid 1 3 0,6 0,64 0,41 0,2 CHCl3: Etylaxetat (1,5:1) Cephalotaxine Cặn chiết Alkaloid 1 3 0,64 0,66 0,44 0,2 CHCl3: Etylaxetat (2:1) Cephalotaxine Cặn chiết Alkaloid 1 3 0,62 0,67 0,51 0,15 CHCl3:MeOH (99:1) Cephalotaxine Cặn chiết Alkaloid 1 2 0,53 0,69 0,32 CHCl3:MeOH (17:3) Cephalotaxine Cặn chiết Alkaloid
Vệt chất chạy dài cao gần bằng chiều cao cột dung môi CHCl3:MeOH (97:3) Cephalotaxine Cặn chiết Alkaloid 1 3 0,8 0,8 0,75 0,33 n-hexan:Etyl Axetat (2:3) Cephalotaxine Cặn chiết Alkaloid 1 3 0,93 0,79 0,5 0,17 CHCl3:MeOH:acetonitrile (97:2:1) Cephalotaxine Homoharringtonine Cặn chiết Alkaloid 1 1 2 0.61 0.25 0.61 0.25 2.2.5 Phân lập các alkaloid bằng sắc ký cột a) Quy trình A (Sơ đồ 2.2)
Cho silicagel (Wako, cỡ hạt 75 ~ 150μm) vào n-hexan và khuấy đều cho đến khi hết bọt khí. Sau đó nạp silicagel ở dạng bột nhão vào cột sắc ký (Φ = 1,5 cm i.d.) đến chiều cao 10cm. Cho dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần để nén đều
Sơ đồ 2.2 : Quy trình A để tách cephalotaxine từ phần chiết alkaloid thơ
Alkaloid thơ (0,326g) đƣợc hồ tan trong CHCl3 : MeOH = 9 :1 với thể tích khoảng 2ml. Rửa giải cột sắc ký gradient bằng 200ml dung môi CHCl3 : MeOH = 9:1 và 50ml MeOH. Thu làm 39 phân đoạn (PĐ). Từng phân đoạn đƣợc cất loại dung môi, chạy sắc ký bản m ng. Các phân đoạn 1 đến 32 đƣợc gom lại thành nhóm A1. Các phân đoạn 33 đến 39 giống nhau đƣợc gom lại thành nhóm A2. So sánh Rf của nhóm A2 và Rf của chất chuẩn cephalotaxine cho thấy nhóm A2 giàu
cephalotaxine. Nhóm các phân đoạn A2 đƣợc gộp lại và cơ quay loại b hồn tồn dung môi, cho chạy sắc ký cột nhôm oxit cỡ hạt 63-200 μm (Merck, Đức) bằng 150ml hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 97 :3; cuối cùng bằng 30ml MeOH. Thu làm 43 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc cất loại dung môi, kiểm tra bằng sắc ký bản m ng silicagel. Các phân đoạn 1-11 có Rf giống nhau, gộp làm nhóm A2.1. Các phân đoạn từ 12 đến 43 không xác định đƣợc Rf gộp làm nhóm phân đoạn
A2.2. So sánh Rf của A2.1 với Rf của chất chuẩn thấy nhóm phân đoạn A2.1 giàu
cephalotaxine. Nhóm phân đoạn A2.1 đƣợc phân tích sắc ký HPLC để xác định
hàm lƣợng.
b) Quy trình B
b1) Dùng sắc ký bản mỏng điều chế (Sơ đồ 2.3)
Alkaloid thô đƣợc chạy sắc ký bản m ng điều chế bằng nhôm oxit TLC Aluminium oxide 60 F254 (Merck) trên nền thủy tinh. Hỗn hợp dung môi đƣợc sử dụng là CHCl3 : MeOH = 97 :3. Chỉ thị là đèn UV 254nm. Sắc ký cột silicagel Alkaloid thô A1 (PĐ1- PĐ32) A2, Rf = 0.19 (PĐ33- PĐ39 A2.1, Rf=0.84 (PĐ1- PĐ11) A2.2 (PĐ12- PĐ43) Sắc ký cột nhôm oxit
Sơ đồ 2.3 : Sử dụng sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit để phân tách alkaloid thô
Dùng đèn UV bƣớc sóng 254nm để hiển thị thấy xuất hiện 2 vệt với Rf lần lƣợt là 0,75; 0,46. Cạo lấy vệt chất có Rf = 0,75, hịa tan trong dung mơi methanol, lọc b nhôm oxit. Dịch chiết trong methanol đƣợc cơ quay loại b hồn tồn dung môi, ký hiệu là B.a.
B.a đƣợc cho chạy sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit TLC Aluminium
oxide 60 F254 (Merck) trên nền thủy tinh, dung môi CHCl3 : MeOH (97 :3). Hiển thị các vệt chất dƣới đèn UV bƣớc sóng 254nm thấy xuất hiện 3 vệt chất có Rf tƣơng ứng là 0,8;0,75; 0,33. Vệt chất có Rf =0,8 tƣơng ứng với Rf chất chuẩn cephalotaxine.
b2) Dùng sắc ký cột điều chế nh m oxit (Sơ đồ 2.4)
Alkaloid thô đƣợc cho chạy sắc ký cột nhôm oxit cỡ hạt 63-200 μm (Merck, Đức), hệ dung môi gradient nhƣ sau: 120ml CHCl3 : MeOH = 97 : 3; 150ml CHCl3 : MeOH = 95: 5; 40 ml MeOH. Thu làm 72 phân đoạn. Mỗi phân đoạn sau khi cất loại dung môi đƣợc kiểm tra bằng sắc ký bản m ng nhôm oxit. Các phân đoạn từ 1 đến 11 có Rf giống nhau gộp làm nhóm phân đoạn B1, các phân đoạn từ 12 đến 72 gộp làm nhóm B2. Các nhóm B1, B2 đƣợc cất loại dung môi, kiểm tra
Sắc ký bản m ng nhôm oxit Alkaloid thô
B.a, Rf = 0,75 Vệt chất có Rf = 0,46 chiết trong MeOH, lọc b nhôm oxit sắc ký bản m ng nhơm oxit
Vệt chất có Rf = 0,8
(tƣơng đƣơng chất chuẩn Cephalotaxine)
bằng sắc ký bản m ng và so sánh với Rf của chất chuẩn cho thấy B1 là nhóm giàu cephalotaxine.
Mẫu B1 đƣợc đƣa đi phân tích HPLC để xác định hàm lƣợng. Sau khi tính
tốn, hiệu suất Cephalotaxine là 35mg, đạt 0,007%, homoharingtonine là 52,5 mg, đạt 0,0105% (trong 500g mầu).
Sơ đồ 2.4: Sử dụng sắc ký cột nhôm oxit để phân tách alkaloid thơ c) Quy trình C (Sơ đồ 2.5) c) Quy trình C (Sơ đồ 2.5)
Alkaloid thơ C đƣợc hịa tan trong dung môi methanol với thể tích tối
thiểu đến khi tan hết. Cho than hoạt tính vào dịch chiết, khuấy trong 45 phút. Lọc b than hoạt tính thu dịch chiết ký hiệu là C1. Cất loại bớt dung mơi, cịn lại 20ml, kết tinh lại trong đá lạnh, xuất hiện các tinh thể vơ định hình màu trắng đục. Lọc hút để thu tinh thể C2. Dịch chiết còn lại đƣợc ký hiệu là C3. C3 đƣợc làm khô
bằng Na2SO4 khan, cất loại dung môi đến 20mL. Kết tinh lại bằng nƣớc đá, thu đƣợc tinh thể vơ định hình màu vàng nhạt. Lọc hút thu tinh thể, ký hiệu là C4, phần dịch chiết trong dung môi methanol cịn lại đƣợc cất loại hồn tồn dung mơi, ký hiệu là C5.
C5 đƣợc hòa tan trong hỗn hợp dung môi MeOH : H2O = 9 :1, chiết bằng n-hexan. Phần tan trong n-hexan đƣợc cất loại dung môi, ký hiệu là C6. Phần tan
trong hỗn hợp MeOH - H2O đƣợc thu hồi và cất loại dung môi, ký hiệu là C7. Sắc ký cột nhôm oxit Alkaloid thô B1, Rf = 0,8 (PĐ1- PĐ11) B2 (PĐ12- PĐ72)
Các mẫu C, C2, C3, C4, C5, C6, C7 đƣợc phân tích bằng HPLC để xác
định hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine. Sau khi tính tốn, hàm lƣợng cephalotaxine là 15 mg, đạt 0,003 %, homoharringtonine 30 mg đạt 0,006%.
Sơ đồ 2.5: Quy trình B để tách cephalotaxine từ phần chiết alkaloid thô d) Quy tr nh D (Sơ đồ 2.6) d) Quy tr nh D (Sơ đồ 2.6)
Alkaloid thô đƣợc hịa tan hồn tồn trong lƣợng tối thiểu methanol. Cho than hoạt tính vào dịch chiết, khuấy trong 45 phút. Lọc b than hoạt tính, thu dịch chiết trong methanol. Cất loại hồn tồn dung mơi ở áp suất thấp thu đƣợc hỗn hợp alkaloid ký hiệu là O.
Hỗn hợp alkaloid O đƣợc hòa tan trong một lƣợng vừa đủ methanol, trộn đều với một lƣợng nh nhôm oxit cỡ hạt 63-200 μm (Merck, Đức). Sau khi dung
Tinh thể C2 Dung dịch C3 Than hoạt tính C1 Alkaloid thô C Kết tinh lại Dung dịch C5 Tinh thể C4 Kết tinh lại
Chất tan trong n-hexan C6 Chất không tan trong n-hexan C7 Chiết với n-hexan
mơi bay hơi hồn tồn, hỗn hợp đƣợc tách bằng sắc ký cột nhôm oxit đã chuẩn bị sẵn, kích thƣớc hạt tƣơng tự. Rửa giải cột bằng 200ml hỗn hợp dung môi, gradient: CHCl3 : MeOH : acetonitrile 97:2 :1 và cuối cùng bằng 50ml MeOH. Thu làm 22 phân đoạn. Mỗi phân đoạn sau khi cất loại dung môi đƣợc kiểm tra bằng sắc ký bản m ng nhôm oxit. Các phân đoạn từ 1 đến 8 có Rf giống nhau gộp lại thành O1. Các phân đoạn từ 9 đến 22 gộp lại thành nhóm O2.
Các nhóm phân đoạn O1 và O2 đƣợc cơ loại hồn tồn dung mơi, kiểm tra bằng sắc ký bản m ng, so sánh với Rf của chất chuẩn, O2 là nhóm phân đoạn giàu homoharringtonine (Rf = 0,25) và O1 là nhóm phân đoạn chứa cả
homoharringtonine và cephalotaxine (Rf = 0,25 và 0,61).
Sơ đồ 2.6: Phân lập alkaloid bằng than hoạt tính và cột nhơm oxit
Cephalotaxine Kết tinh lại Homoharringtonine Kết tinh lại O2 O1 Than hoạt tính O Alkaloid thô M Sắc ký cột nhôm oxit O1.1 O1.2 Sắc ký bản m ng nhôm oxit Homoharringtonine Kết tinh lại
Nhóm phân đoạn O1 đƣợc gom lại, cất loại dung mơi và hịa tan với một lƣợng vừa đủ methanol. Sau đó, tách alkaloid bằng sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit TLC Aluminium oxide 60 F254 (Merck), hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH : acetonitrile 97:2 :1, thu đƣợc hai phân đoạn chất O1.1 và O1.2 có Rf tƣơng đƣơng
với Rf của cephalotaxine và homoharringtonine.
Cạo lấy phần O1.1 và O1.2, hòa tan trong lƣợng CHCl3 vừa đủ vào hai lọ, lọc b nhôm oxit, thu đƣợc hai phần dịch chiết tƣơng ứng là O1.1 và O1.2. Kết tinh lại O1.1 và O1.2, lọc hút, từ O1.1 thu đƣợc 15mg tinh thể cephalotaxine và từ O1.2, 10,75mg homoharringtonine.
Nhóm phân đoạn O2 đƣợc gom lại, cất loại dung môi và kết tinh lại trong methanol thu đƣợc 10mg homoharring-tonine. Nhƣ vây, hàm lƣợng cephalotaxine đạt 0, 003%, homoharringtonine 0,004%.
2.2. 6. Xác định hàm lƣợng alkaloid bằng sắc ký HPLC a) Khảo điều kiện phân tích thích hợp cho máy HPLC a) Khảo điều kiện phân tích thích hợp cho máy HPLC
Thiết bị HPLC đƣợc sử dụng cho nghiên cứu này đƣợc cung cấp bởi hãng Shimadzu (Nhật Bản) với detector PDA SPD-M10Avp; cột Cadenza C18 250*46mm, kích thƣớc hạt 3µm.
Thể tích bơm mẫu là 20 µL, nhiệt độ lị là 30o
C, tốc độ dòng là 1.0mL/phút. Pha động là hỗn hợp dung môi nƣớc và acetonitrile. Hai chƣơng trình gradient dung môi đã đƣợc khảo sát để lựa chọn chƣơng trình sắc ký phù hợp cho hiệu quả tách cephalotaxine và homoharringtonine tốt nhất.
Ở chƣơng trình gradient 1, pha động bắt đầu với 0% acetonitrile, thành phần acetonitrile tăng dần tuyến tính tới khi đạt 30% ở phút thứ 20. Sau đó acetonitrile đƣợc tăng dần đều tới 100% ở phút thứ 30 và giữ ngun khơng đổi trong vịng 10 phút. Sau đó thành phần acetonitrile giảm nhanh xuống 0% trong 10 phút và giữ nguyên tỉ lệ đó tới phút thứ 55, là lúc kết thúc quy trình phân tích.
Ở chƣơng trình gradient 2, thành phần acetonitrile tăng tuyến tính từ 0% đến 30% trong vòng 35 phút đầu tiên. Tiếp theo, acetonitrile đƣợc tăng lên tới 100%.