Sơ lược về sinh tổng hợp HePS

1.4.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Kefiran hiện nay.

Hiện nay, kefiran là dòng sản phẩm chức năng mới được sử dụng thông dụng tại Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc, dưới dạng bột, viên nén, dạng sệt…, có tác dụng điều hịa glucose trong máu, điều hòa huyết áp, kháng vi sinh, nâng cao chức năng miễn dịch cũng như chức năng gan [18], [26], [27], [30]. Kefiran đã được nhập khẩu vào Việt Nam, được sử dụng như thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm thực dưỡng.

Thông thường, các sản phẩm kefiran thường được sản xuất từ nguyên liệu là sữa tươi từ động vật hoặc từ môi trường tổng hợp. Điều đó dẫn đến việc chi phí cho nguồn nguyên liệu cao, nhiều người có khả năng dị ứng với nguồn lactose từ sữa hoặc không sử dụng sản phẩm từ động vật khơng thể tiếp cận đến sản phẩm. Vì vậy, việc đánh giá, khảo sát quá trình lên men lactic giàu kefiran từ gạo lứt để tạo sản phẩm giàu kefiran có nguồn gốc từ các loại hạt giúp đa dạng đối tượng có thể tiếp cận sản phẩm. Việc sử dụng dịch gạo lứt thủy phân cho quá trình lên men cũng đáp ứng được một phần về mặt dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic phát triển. Ngoài ra,

nguồn nguyên liệu là gạo lứt cũng được đánh giá là phổ biến và rẻ hơn nguồn dinh dưỡng là sữa. Bên cạnh đó cũng tận dụng được nguồn nguyên liệu, đa dạng hóa sản phẩm từ gạo lứt của Việt Nam.

Đối với sản phẩm bột gạo lứt lên men lactic đã có một số nghiên cứu của các nhóm tác giả quan tâm tới khả năng lên men lactic của vi khuẩn lactic trên mơi trường gạo lứt [4]. Nhóm tác giả từ trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội đã có một số kết quả nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống lên men lactic từ gạo lứt [3]. Tuy nhiên, đây là dịng sản phẩm đồ uống có chứa acid lactic tương tự dạng sữa chua nhưng trên mơi trường gạo nên về cảm quan cịn nhiều điểm chưa lôi cuốn được người tiêu dùng. Sản phẩm này hoàn toàn khác với sản phẩm lên men kefiran bởi vi khuẩn lactic. Các nghiên cứu này cũng chỉ dừng ở quy mơ phịng thí nghiệm. Hiện nay, chúng tơi chưa tìm thấy một cơng trình nghiên cứu trong nước liên quan tới lên men kefiran từ vi khuẩn latic trên môi trường gạo lứt tại Việt Nam. Trên thị trường hiện nay, sản phẩm kefiran đã được nhập nhiều về Việt Nam cho các đối tượng ăn thực dưỡng, ăn chay, chữa bệnh, thậm chí một số khách hàng thuộc nhóm đối tượng khác cũng sử dụng thường xuyên sản phẩm kefiran như dạng thực phẩm chức năng để phịng bệnh.

Ngồi ra, trên thế giới cũng đã có một số nghiên cứu khả năng sản xuất kefiran của một số chủng lactic trên các môi trường khác nhau như môi trường tổng hợp, môi trường từ lactose, đậu nành, tiểu mạch. Các nghiên cứu này đều cho kết quả khả quan về việc tạo các sản phẩm giàu kefiran có nguồn gốc khác với sữa động vật.

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu

- Gạo lứt Khang Dân (Oryza sativa L. var Indica): được thu mua tại xã Xuân Hồng, huyện Xuân Trường, tỉnh Nam Định.

- Vi khuẩn: vi khuẩn lactic được phân lập từ nguồn nấm sữa Kefir thu thập trên địa bàn Hà Nội.

- Enzyme thương mại: Termamyl SC, Dextrozyme GA, Neutrase 0,8L được cung cấp bởi công ty Novozymes (Đan Mạch). Đây là enzyme endo-amylase với độ hoạt động là 120 KNU-S/g.

- Hóa chất: được cung cấp bởi Công ty Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Trung Quốc, Việt Nam.

+ Hóa chất mơi trường: Pepton, cao thịt, cao nấm men, glucose, saccharose, tween 80, K2HPO4, CH3COONa, Triamonium citrate, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, muối tinh…

+ Hóa chất phân tích: DNS, Na2CO3, CuSO4, C4H4K2O6.H2O, phenol, phenol reagent, cồn, phenolphtalein, K3Fe(CN)6, KOH, methylen blue, methyl orange, HCl, NaOH…

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

Các dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong quá trình nghiên cứu được sự cho phép từ Bộ môn Công nghệ lên men, Viện Công nghiệp thực phẩm.

- Dụng cụ: pipetman, pipet thủy tinh, ống nghiệm nút xốy, đĩa petri, que cấy, que trang, bình tam giác, lọ thủy tinh, đũa thủy tinh, cốc đong, bình định mức…

STT Tên thiết bị Xuất xứ 1 Tủ sấy khử trùng New Zealand 2 Nồi hấp áp lực Nhật Bản 3 Kính hiển vi điện tử Nhật Bản 4 Buồng cấy vô trùng Singapo

5 Tủ ấm New Zealand

6 Máy Vortex Mỹ

7 Cân phân tích Thụy Sỹ

8 Cân điện tử Thụy Sỹ

9 Máy đo pH Nhật Bản

10 Máy quang phổ khả biến Mỹ 11 Thiết bị lên men 2 L Italia

12 Máy sấy phun Trung Quốc

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh 2.2.1. Phương pháp vi sinh

2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn lactic được phân lập từ các hạt kefir trên mơi trường MRS có bổ sung 0,5% CaCO3. Lấy 10 gram mẫu nghiền trong 90 ml nước muối sinh lý NaCl 0,85%. Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Mẫu được ngâm trong 30 phút để hịa tan mẫu và giải phóng tế bào vào nước muối sinh lý. Hút phần dịch nổi và tiến hành pha lỗng cấp độ 10, sau đó lấy 100 ml các dịch mẫu pha loãng từ nồng độ 10- 6 đến 10-2, đưa lên đĩa petri chứa mơi trường thích hợp, cấy gạt và nuôi ở 30°C trong 2 ngày. Chọn lọc vi khuẩn lactic dựa vào hình thái khuẩn lạc. Những dịng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, khơng màu, bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy. Các khuẩn lạc này nằm trên đường cấy chuyển và khơng lẫn với các khuẩn lạc có màu sắc và hình thái khác lạ.

cách nhuộm Gram và thử catalase (Ashmaig et al. 2009). Vi khuẩn lactic được xác định: có hình trịn hoặc hình que, khơng sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính và phân giải được CaCO3.

2.2.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng tạo sinh khối vi khuẩn lactic

▪ Xác định mật độ tế bào: đếm trực tiếp số lượng tế bào trên buồng đếm hồng

cầu. Lượng tế bào vi khuẩn được tính theo cơng thức: N (CFU/ml) = a × 0,25 × 106

Trong đó: a là số tế bào vi khuẩn trung bình đếm được trong 1 ơ (1 ơ có 16 ơ nhỏ).

▪ Đo độ đục của sinh khối: Ly tâm 2 ml dịch lên men (chứa vi khuẩn) ở 8000

v/p trong 5 phút. Sinh khối vi khuẩn thu được tiếp tục được rửa (ly tâm 8000 v/p trong 5 phút) 2 lần bằng nước vơ trùng. Hịa sinh khối với 1,5 ml nước cất. Đo độ đục (OD) của sinh khối ở λ = 600 nm. OD đo được càng lớn chứng tỏ sinh khối thu được càng nhiều.

2.2.1.3. Phương pháp định tên chủng giống

Việc xác định tên loài của chủng lựa chọn dựa vào trình tự đoạn gen mã hóa16S rRNA.

Tách chiết DNA tổng số: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường LB dịch thể

trong 20-24 giờ ở 37°C, 160 rpm. Tế bào thu được sau khi ly tâm, bỏ dịch được tách DNA tổng số bằng E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega). DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.

- Phản ứng PCR: Đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR

sử dụng cặp mồi 27F, 5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'; và 1492R 5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3' trên máy Eppendorf™ Mastercycler™ pro PCR System (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) với chu trình nhiệt như sau: 94C trong 3 phút; 30 chu kỳ (94 C trong 30 giây, 52 C trong 30 giây và 72 C trong 1 phút); 72 C trong 10 phút và bảo quản ở 20 C. Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được đọc trình tự trên hệ thống 3730xl DNA Analyzer (Thermo Scienctific, Mỹ)

theo phương pháp Sanger. Trình tự gen 16S rRNA được so sánh với các trình tự đã công bố sử dụng cơ sở dữ liệu của EzBioCloud. Cây phân loại được thiết lập dựa trên phương pháp thống kê Neighbor-Joining (NJ) thông qua chương trình MEGA7. Giá trị bootstrap xuất hiện ở mỗi nhánh được thiết lập từ sau 1000 lần lặp lại.

2.2.2. Phương pháp phân tích hóa lý

2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp DNS.

▪ Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit

dinitrosalicylic DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với nồng độ đường khử trong phạm vi nhất định. Dựa trên đồ thị đường chuẩn đối với glucoza tinh khiết tính được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích.

▪ Dụng cụ: Máy so màu, 10 ống nghiệm loại 20ml, 10 ống nghiệm loại 5ml, 1

bình định mức 100ml, máy đo độ ẩm, cuvet, giấy lọc.

▪ Hóa chất:

- Axit dinitrosalicylic DNS

- Muối tactarat kép KNaC4H4O6.4H2O - NaOH dung dịch 2M

Cân 0,25g DNS và 75g KNaC4H4O6.4H2O trong 50 ml NaOH 2M (4g NaOH trong 50 ml nước cất) định mức tới 250 ml bằng nước cất, bảo quản trong bình nâu ở 4°C trong 2 tuần.

▪ Tiến hành:

- Dựng đường chuẩn glucoza: Cân glucoza tinh khiết 99% sấy 105°C tới khô tuyệt đối rồi cân 1g phân tích hịa tan đường glucoza bằng nước cất và định mức tới 100 ml.

Nồng độ glucose chuẩn (mg/l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Số ml dung dịch glucose 1 g/l 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Số ml nước cất 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 Sau đó lấy 100 µl các nồng độ pha loãng trên vào ống nghiệm 5ml (hoặc eppendorf) thêm 1000 µl DNS lắc kỹ, đun cách thủy 10 phút làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phịng (100 µl nước cất + 1000 µl DNS làm mẫu trắng chỉnh máy so màu về 0) rồi đo trên máy so mầu với bước sóng 570 nm.

Vẽ đồ thị chuẩn với trục tung là OD, trục hoành là nồng độ đường (mg/ml)

▪ Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu:

Pha loãng mẫu sao cho hàm lượng đường khử trong khoảng 0,12- 0,42 mg/ml rồi tiến hành đo xác định như trong phần dùng đồ thị chuẩn.

Dựa vào đồ thị đường chuẩn đã dựng, tra được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích.

Chú ý: Màu của hỗn hợp chỉ tạo ra trong môi trường kiềm, do vậy những mẫu

axit phải được trung hịa trước khi đem phân tích. Các mẫu đã được đun có thể để được một thời gian (20 phút) trước khi đo. Các mẫu không đun sẽ bị phân hủy dần dần.

2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng axit tổng (theo axit lactic)

Axit tổng số của một dung dịch là một tiêu chuẩn để đánh giá tất cả những ion hydro (H+) của cả những axit dễ bay hơi và những axit khơng bay hơi có mặt trong dung dịch.

▪ Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trung hịa các axit có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Từ lượng dịch kiềm tiêu hao, ta tính được lượng axit tổng số có trong mẫu.

▪ Cách tiến hành:

- Hút 20 ml dịch sau lên men vào bình tam giác 100 ml. - Nhỏ 1- 2 giọt phenolphthalein 0,1 % vào, lắc đều.

- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Vừa chuẩn vừa lắc, đến khi dung dịch chuẩn sang màu hồng nhạt thì dừng lại.

▪ Cách tính hàm lượng axit tổng trong dung dịch:

Những loại axit trong dung dịch được quy về một axit chung là axit lactic (C3H6O3)

C3H6O3 + NaOH → C3H5O3Na + H2O Lượng axit trong dịch sau lên men được tính theo cơng thức:

m (g/l) = K ×VNaOH

Vmẫu

Trong đó:

m : khối lượng của axit lactic (g/l)

K : hệ số quy đổi ra axit (với axit lactic K = 0,009) VNaOH : thể tích NaOH 0,1N đã dùng (ml)

Vmẫu : thể tích mẫu đã sử dụng (ml)

2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chất khơ hịa tan

Hàm lượng chất khơ hịa tan được xác định bằng chiết quang kế (Đức).

2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng kefiran (exopolysaccharide)

Phương pháp này dựa trên khả năng không tan trong ethanol và tan trong nước nóng của exopolysaccharide (phương pháp mô tả bởi Cheirsilp).

Sau thời gian nuôi cấy, dịch lên men được ly tâm tốc độ 15.000 v/p/10 phút ở 30°C để thu dịch trong. Hút 10 ml phần dịch trong sang ống facol, bổ sung 20 ml cồn lạnh để ở -20°C trong 24 giờ để làm kết tủa kefiran. Ly tâm 8.000 v/p/10 phút ở 4°C thu kết tủa. Hòa tan phần kết tủa trong 10 ml nước, đun sơi trong 10-15 phút, vortex để hịa tan lượng kefiran trên màng tế bào. Tiếp tục bổ sung 20 ml cồn lạnh, để ở -20°C trong 24 giờ và ly tâm 8.000 v/p/10 phút ở 4°C thu kết tủa. Kết tủa được hòa lại trong 10 ml nước nóng (>95°C) và được ly tâm lần cuối 8.000 v/p/10 phút ở 30°C, thu dịch trong. Dịch này dùng để xác định hàm lượng kefiran trong dịch lên men, được bảo quản ở -20°C cho đến khi phân tích. Sử dụng phương pháp xác định hàm lượng đường DNS để định lượng kefiran.

2.2.3. Phương pháp công nghệ

2.2.3.1. Phương pháp thủy phân bột gạo lứt

Gạo lứt sau khi tiến hành rang và nghiền thành bột sẽ được tiến hành thủy phân qua các bước sau:

- Hòa bột gạo lứt với nước theo tỉ lệ 1:4 và được bổ sung 0,2% enzyme Termamyl rồi đưa lên nhiệt độ 90°C giữ trong 30 phút.

- Sau khi kết thúc giai đoạn dịch hóa, khối dịch được hạ nhiệt độ xuống 52°C. Bổ sung 0,2 % Neutrase thực hiện giai đoạn đạm hóa.

- Tiếp theo, nâng nhiệt độ toàn khối lên 65°C và bổ sung 1,5% Dextrozyme, giữ trong 60 phút để thủy phân toàn bộ tinh bột thành đường.

- Bước cuối, nâng nhiệt độ khối dịch lên 72°C giữ trong 30 phút để thủy phân nốt các dextrin còn lại, rồi lọc thu phần dịch trong.

- Dịch gạo sau quá trình thủy phân được pha loãng về nồng độ thích hợp và hấp thanh trùng 115°C/15 phút, dùng để nuôi cấy vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu.

Các thí nghiệm được tiến hành trong các bình schott 500 ml. Dịch lên men là môi trường gạo lứt đã hồ hóa, được bổ sung dinh dưỡng theo các mục đích thí nghiệm. Chủng vi khuẩn lactic sau khi được hoạt hóa (trong mơi trường cấp 1, cấp 2), ly tâm thu sinh khối, được bổ sung vào môi trường lên men. Theo dõi thông số của quá trình lên men theo thời gian.

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho q trình lên men gạo lứt giàu kefiran

3.1.1. Phân lập và sơ tuyển chủng vi khuẩn lactic

Tiến hành thu thập các mẫu hạt kefir, các hạt kefir trong môi trường sữa tươi không đường được lọc, tách hạt, đem rửa nhẹ bằng nước cất, và tiến hành phân lập. Từ các mẫu hạt Kefir, tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic có trong hạt Kefir. Sử dụng mơi trường MRS có bổ sung 0,5% CaCO3 để lựa chọn vi khuẩn lactic. Sau khi lựa chọn, các chủng lactic được tiến hành xác định tốc độ sinh trưởng trên môi trường MRS lỏng trong 24 giờ. Kết quả quá trình khảo sát của các chủng vi khuẩn lactic được thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn lactic

TT Kí hiệu Xuất xứ Hình thái khuẩn lạc

1 LK1 Nguyễn Phong

Sắc, Cầu Giấy

Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đơi.

2 Đại La, Hai Bà

Trưng

Khuẩn lạc trịn, trơn, bóng, trắng sữa. Tế bào hình cầu, hơi dài kết đôi.

3 LK3 Nguyễn An

Ninh, Hai Bà Trưng

Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.

4 LK4 Hồng Hà, Hoàn

Kiếm

Khuẩn lạc trịn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.

5 LK5 Kim Đồng, Hai

Bà Trưng

Khuẩn lạc trịn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đơi.

6 LK6 Nguyễn Ngọc

Nại, Thanh Xn

Khuẩn lạc trịn, trơn, bóng, trắng sữa. Tế bào hình que, ngắn đơn lẻ, kết đơi.

7 LK7 Nghĩa Tân, Cầu Giấy

Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.

8 LK8 Hoàng Hoa

Thám, Ba Đình

Khuẩn lạc trịn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.

9 LK9 Liễu Giai, Ba

Đình

Khuẩn lạc trịn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que,