3.1 Kết quả nghiên cứu in silico họ gen OsNHX
3.1.1.3 Phân tích cấu trúc của protein
a) So sánh trình tự amino acid đƣợc mã hóa bởi các gen thuộc họ gen OsNHX
Trình tự amino acid của đƣợc mã hóa bởi 5 gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa đƣợc thu thập và xử lý từ cở sở dữ liệu RAGP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu) và
Phytozome v10.2 database (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). Qua phân tích dữ liệu cho thấy, protein thuộc họ gen OsNHX có số amino acid vào khoảng từ 528 đến 549 với mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid dao động từ 19,75% đến 72,61%. Các protein OsNHX1 đến OsNHX3 có độ tƣơng đồng cao nhất (>70%), trong khi protein
OsNHX5 có độ tƣơng đồng thấp nhất khi so sánh với 4 protein còn lại (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid các protein họ OsNHX
protein (%) OsNHX5 x 21.193 19.749 20.57 20.382 OsNHX4 21.193 x 51.872 50.799 52.151 OsNHX3 19.749 51.872 x 71.245 70.26 OsNHX2 20.57 50.799 71.245 x 72.61 OsNHX1 20.382 52.151 70.26 72.61 x Kích thƣớc protein (aa) 549 528 544 545 535
b) Dự đoán cấu trúc xuyên màng các phân tử protein thuộc họ protein OsNHX
Cấu trúc bậc 2 của các protein OsNHX đƣợc biểu thị dƣới các dạng xoắn, các miền xuyên màng, miền bên trong hay bên ngồi bào quan và những miền có chức năng quan trọng. Sử dụng một số cơ sở dữ liệu dự đốn mơ hình cấu trúc protein nhƣ, FFAS03, SWISS-MODEL và Phyre2 chúng tôi đã xác định rằng các protein OsNHX đƣợc giải thích dựa mơ hình mẫu (c4cz8A) cấu trúc tinh thể protein PaNhaP của vi khuẩn
Pyrococcus abyssii. Kết quả phân tích này cũng phù hợp với dữ liệu từ Pfam cho phép
chúng tôi khẳng định họ protein PaNhaP ở vi khuẩn và họ protein OsNHX có điểm chung về nguồn gốc phát sinh chủng loại. Xác định các miền protein xuyên màng họ protein OsNHX bằng công cụ mô phỏng cấu trúc protein tại http://wlab.ethz.ch/protter/# và http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl. Kết quả mô phỏng cho biết protein OsNHX1,
OsNHX3và OsNHX2 (Hình 3.3a, 3b và 3.3c) đều có 12 miền xuyên màng. Mặc dù Protein OsNHX4 và OsNHX5 đều có 11 miền xuyên màng tuy nhiên chúng lại khác biệt nhau rõ rệt về mặt cấu trúc (3.3d và 3.3e). Trong 5 phân tử protein chỉ có protein OsNHX5 là có tín hiệu peptid ở đầu N (Hình 3.3e). Kiểu dạng hình học các protein OsNHX1 và OsNHX3 cho thấy sự giống nhau rõ rệt về sự sắp xếp trật tự các miền xuyên màng, trong màng, ngồi màng và cả vị trí xảy ra sự N-glyco hóa.
Hình 3.3a Mơ hình cấu trúc các miền protein xun màng OsNHX1
Hình 3.3c Mơ hình cấu các miền protein xuyên màng OsNHX3
Hình 3.3e Mơ hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX5
Hình 3.3a đến 3.3c (OsNHX1 đến OsNHX3) cho thấy chúng đều có 12 miền xuyên màng chứng tỏ chúng đƣợc xếp cùng nhóm chức năng đó là trao đổi Na+
/H+ ở màng khơng bào. Mặc dù protein OsNHX4 có 11 miền protein nhƣng những miền quan trọng nhƣ miền 3, 6, 7 đều giống với các miền 3,6,7 của các protein OsNHX1, OsNHX2 và OsNHX3. Do đó các protein OsNHX1 đến OsNHX 4 đều thực hiện chức năng ở màng khơng bào. Riêng OsNHX5 (hình 3.3e) có tín hiệu peptid ở đầu N và có các miền 3,6,7 khác với 4 protein cịn lại. Do đó OsNHX5 trao đổi Na+/H+ ở màng hệ Gônghi.
Khả năng hoạt động của các antiporter NHX nói chung đƣợc kiểm sốt bởi một vị trí bám đặc hiệu bởi phân tử amiloride tại miền TM3 của hầu hết các protein tƣơng đồng
họ NHX. Vị trí này có trình tự đặc trƣng là LFFIYLLPPI, có tính bảo thủ cao và ảnh hƣởng đến khả năng kìm hãm hoạt động các antiporter [24], [38].
Mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid và kiểu dạng hình học cấu trúc protein cũng thể hiện sự khác biệt giữa các miền. Đầu N có sự tƣơng đồng cao hơn trong khi đầu C có sự tƣơng đồng thấp hơn đặc biệt là các vị trí sau miền TM12 trở đi.
c) Dự đoán cấu trúc bậc 3 các phân tử protein thuộc họ gen OsNHX
Để xác định mơ hình cấu trúc bậc 3 họ protein NHX chúng tơi tiến hành alignment trình tự acid amin của các protein từ OsNHX1 đến OsNHX5 với các cơ sở dữ liệu FFAS03, SWISS-MODEL và PFAM. Phân tích mơ hình protein từ Phyre2 kết hợp với so sánh với các cơ sở dữ liệu trên, chúng tơi đã định xác rằng mơ hình cấu trúc bậc 3 protein OsNHX đƣợc giải thích dựa mơ hình mẫu (c4cz8A) cấu trúc tinh thể protein
PaNhaP của vi khuẩn Pyrococcus abyssii. Kết quả phân tích cho thấy mơ hình 3D protein từ OsNHX1 đến OsNHX5 có mức độ tƣơng đồng với mơ hình gốc (c4cz8A) lần lƣợt là: 23%, 22%, 23%, 19% và 21% (các hình 3.4a, 3.4b, 3.4c, 3.4d và 3.4e).
Hình 3.4c Mơ hình 3D protein OsNHX3 Hình 3.4d Mơ hình 3D protein OsNHX4
Hình 3.4e Mơ hình 3D protein OsNHX5
d) Đánh giá mơ hình cấu trúc 3D của các protein thuộc họ protein OsNHX ở lúa
Mơ hình 3D các phân tử protein thuộc họ OsNHX đƣợc phân tích định lƣợng bằng các chƣơng trình nhƣ ProSA-web và VADAR ver1.8. Đánh giá cơ sở dữ liệu các protein OsNHX bằng cách tính tốn chỉ số Z-score của mỗi mơ hình protein 3D OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4 và OsNHX5 so sánh với mơ hình mẫu (Phụ lục 1).
Kết quả đánh giá định lƣợng cơ sở dữ liệu bằng ProSA cho thấy protein OsNHX1 có giá trị Z-score là -3.7 gần với giá trị của mơ hình mẫu c4cz8A (Z-score là -4.68). Các protein
cịn lại có giá trị thấp hơn đặc biệt là protein OsNHX4 có giá trị Z-score khá thấp. Do đó để đánh giá mức độ tin cậy của các mơ hình 3D protein OsNHX chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phân tích điểm Ramachandran.
Kết quả phân tích điểm Ramachandran bằng chƣơng trình VADAR ver.1.8 đƣợc thể hiện ở hình 3.5 và các hình 7, 8, 9, 10 ở phụ lục 1. Biểu đồ điểm (plot) cho thấy vị trí phân bố các gốc amino acid tại hai miền góc xoắn (torsion angles) là Phi (Φ) and Psi (Ψ), ngoại trừ các amino acid phân bố tại đầu cuối mỗi chuỗi polipeptid. Gốc glycine đƣợc biểu thi bằng hình tam giác màu đen. Các gốc amino acid nằm trong vùng lõi (màu đỏ) biểu thị vùng phân bố có ƣu thế nhất (most favored) còn các gốc amino acid nằm trong vùng màu vàng (allowed) và xanh đƣợc gọi là vùng đƣợc phép thay đổi mở rộng (generously allowed). Vùng khơng cho phép có mặt các amino acid đƣợc thể hiện bằng màu xám (miền Outside). Mơ hình protein 3D gọi là có ý nghĩa khi có ít nhất 90% gốc amino acid nằm trong vùng màu đỏ (most favored) và vùng màu vàng (allowed).
Kết quả đánh giá bằng VADAR ver1.8 cho thấy hầu các protein đều có trên 90% amino acid nằm trong vùng màu đỏ và màu vàng. Trong số 5 mơ hình protein, OsNHX5 có mơ hình 3D đƣợc đánh giá với tỷ lệ phần trăm thấp nhất (90%) còn OsNHX1 đƣợc đánh giá với tỉ lệ cao nhất (95%). Bảng 3.4.
Bảng 3.4 Chỉ số đánh giá mơ hình 3D của các protein thuộc họ OsNHX
Protein models Core Allowed Generous Outside Total Value(%)
OsNHX1 451 (84%) 63(11%) 16 (2%) 5(0%) 95%
OsNHX2 419 (76%) 91(16%) 14(2%) 21(3%) 92%
OsNHX3 431(79%) 68(12%) 25(4%) 20(3%) 91%
OsNHX4 432(81%) 57(10%) 16(3%) 23(4%) 91%
OsNHX5 414(77%) 71(13%) 22(4%) 28(5%) 90%