(Đƣợc phân tích từ cở sở dữ liệu: http://www.ricearray.org/)
Kết quả phân tích cho thấy gen OsNHX3 biểu hiện rất yếu ở giai đoạn tiền này
mầm trong khi ở giai đoạn 1 lá, 2 lá, 3 lá và giai đoạn đẻ nhánh gen này biểu hiện rất mạnh mẽ nhƣ hình 3.12b. Gen OsNHX5 biểu hiện ổn định qua các giai đoạn phát triển. Sau khi phân tích kết quả của từng gen, chúng tôi tiến hành đánh giá tổng hợp sự biểu hiện các gen bẳng biểu đồ nhiệt đối với 4 gen OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX5, kết quả đánh giá tổng hợp về dữ liệu 4 gen trên đƣợc trình bày ở phụ lục 3.
Riêng với gen OsNHX4 chúng tôi sử dụng cơ sở dữ liệu về biểu hiện gen ở một số trang web nhƣ http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500 và NCBI :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi?ORG=Os&CID=80438
Với những dữ liệu trên Gen OsNHX4 đều đƣợc tra cứu bằng locus Os06G0318500 hoặc
Q5ZA11ở(http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500).
Theo dữ liệu ở NCBI gen OsNHX4 biểu hiện một cách hạn chế ở mô phân sinh
sinh dƣỡng. Kết quả phân tích các trình tự biểu hiện (EST) ở một số mô nhƣ rễ, mô sẹo, mô phân sinh (Bảng 3.6).
Bảng 3.6 Dữ liệu tạo dòng cDNA biểu hiện gen OsNHX4
Dữ liệu biểu hiện gen OsNHX4 tại http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500 cho
thấy sự biểu hiện gen này tại các mô, cơ quan biểu hiện một cách khá hạn chế và hầu nhƣ chỉ biểu hiện mạnh ở giai đoạn phơi. Nhìn chung dữ liệu về sự biểu hiện của gen
OsNHX4 đối với điều kiện stress vẫn chƣa đƣợc tìm thấy (Hình 3.13).
Hình 3.13 Sự biểu hiện của gen OsNHX4 ở một số mơ, cơ quan lúa (Đƣợc phân tích từ
nguồn : http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500).
3.1.3.2. Sự biểu hiện các gen thuộc họ OsNHX trong điều kiện stress
Phân tích sự biểu hiện các gen OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX5 bằng công cụ http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE trong điều kiện mặn. Các nhóm mẫu đƣợc tiến
hành phân tích bao gồm: GSE4438 và GSE3053. Gen OsNHX1 đƣợc phân tích in silico
với probe ID: Os.4700.1.S1_at. Các gen OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX5 có ID lần lƣợt là:Os.14813.1.S1_at;Os.27479.1.S1_at và Os.5237.1.S1_at.
Phân tích dữ liệu in silico các gen OsNHX1, OsNHX2 và OsNHX5 chúng tôi nhận thấy ở giai đoạn sinh trƣởng, sự khác biệt về biểu hiện gen giữa nhóm đối chứng và nhóm xử lú mặn là tƣơng đối nhỏ. Trong khi ở giai đoạn sinh sản mức độ biểu hiện giữa 2 nhóm này là khá rõ nét. Điều này chứng tỏ mặn ảnh hƣởng khá mạnh mẽ đến giai đoạn sinh sản của cây lúa (Hình 3.14). Ở giai đoạn sinh sản, kết quả phân tích cũng ghi nhận các gen OsNHX2 và OsNHX3 đều biểu hiện khá mạnh mẽ của trên giống FL478 (chịu mặn), nhƣng lại biểu hiện khác nhau ở giống lúa mẫn cảm mặn IR29 (Hình 3.14 và 3.15).
Hình 3.15 Sự biểu hiện gen OsNHX3 (c) và OsNHX5 (d) trong điều kiện stress mặn
(Đƣợc phân tích in silico từ nguồn http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE )
Mặc dù IR29 là giống lúa nhạy cảm với stress mặn nhƣng các gen OsNHX2 và OsNHX5 là cho thấy mức độ biểu hiện khá cao ở giống này. Điều này cho thấy ngoài khả
năng chống chịu mặn chúng có thể thực hiện các chức năng trao đổi chất và sinh trƣởng ở khác ở cây lúa. Trong 4 gen đƣợc phân tích, có thể nhận thấy ở điều kiện stress mặn gen
OsNHX5 biểu hiện ở mức độ thấp hơn những gen khác và gen OsNHX1 biểu hiện mạnh
3.2. Kết quả phân tích đa hình vùng promoter của gen OsNHX3 3.2.1. Kết quả phản ứng PCR 3.2.1. Kết quả phản ứng PCR
Sau khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với điều kiện chuẩn nhƣ (bảng 2.3) để nhân bản trình tự promoter của gen OsNHX3 có kích thƣớc
1795bp. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel Agarose với hiệu điện thế 90V, chạy trong đệm TAE1X khoảng 30 phút. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi pro-NHX3 đƣợc trình bày ở hình 3.16. Sản phẩm PCR cho băng sáng, đúng kích thƣớc thiết kế là 1795 bp.
Hình 3.16 Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi pro-NHX3 với nhiệt độ gắn mồi là 550
C từ khuôn ADN tổng số của 12 giống lúa. M: Marker 1kb; (-): đối chứng âm. Tên và ký hiệu các giống lúa được trình bày ở bảng 2.1
3.2.2. Kết quả giải trình tự
Trong luận văn này chúng tơi đã tiến hành PCR thành cơng trình tự promoter của 12 giống lúa (bảng 2.1), tuy nhiên khi giải trình tự chỉ thu đƣợc kết quả của 11 giống lúa. Hình 3.1.7 cho thấy kết quả giải trình tự chiều Rv của giống lúa cƣờm dạng 2 (CD2) với đồ thì các đỉnh rõ nét. Kết quả giải trình tự cho tồn bộ 11 mẫu sẽ đƣợc trình bày ở phụ lục 4.
Sau khi thu đƣợc kết quả giải trình tự nucleotide, chúng tơi tiến hành so sánh trình tự nucleotide trong vùng promoter của 11 giống lúa với trình tự promoter trên database , sử dụng phần mềm trên trang http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ . Kết quả so sánh đƣợc trình bày ở hình 3.18
Hình 3.18 So sánh trình tự promoter của 11 giống lúa với trình tự database (tiếp)
3.2.3. Đánh giá mức độ đa hình vùng promoter các giống lúa nghiên cứu
Các điểm đa hình trong vùng promoter gen OsNHX3 cácgiống lúa nghiên cứu gồm thể hiện nhƣ bảng 3.7.
Bảng 3.7 Vị trí và kiểu thay thế trình tự nuleotid vùng promoter gen OsNHX3 ở các
giống lúa nghiên cứu
Vị trí thay thế Giống Kiểu đa hình CD1 MD2 D1 CR CB C TL CĐ PK -183 G→T X X X x -487 đến -485 Mất đoạn TCT X X X X -635 T→A X - 636 Mất G X X Dị hoán G→T X -638 Thêm C X -641 G→T X -667 Thêm G X -699 G→A X -715 đến – 726 Mất đoạn ACCAAAACCAAA X X X X X X X X X -775 A→G X X X X -790 G→A X X X X X X X X X -810 T→A X X X X X X X X X -817 G→A X X X X X X X X X
Bảng 3.7 Vị trí và kiểu thay thế trình tự nuleotid vùng promoter gen OsNHX3 ở các
giống lúa nghiên cứu (tiếp)
Vị trí thay thế Gi ống Kiểu đa hình CD1 MD2 MD1 CR CB C TL CĐ PK -819 A→T X X X X X X X X X -854 A→G X X X X X -892 C→G X X X X X X X X X -910 G→A X X X X X X X X X -911 A→G X X X -943 G→A X X X X X X X X X -971 C→A X X X X X X X X X -975 G→A X X X X X -987 G→A X X X X -1009 C→T X X X X X X X X X -1029 C→A X X X X -1043 C→T X X X X X X X X X -1059 C→T X X X X -1063 G→A X X X X -1066 G→A X X X X -1070 G→A X X X X -1079 G→A X X X X X X X X X -1085 G→A X X X X X
-1088 G→A X X X X X -1095 A→G X X X X X X X X X -1120 A→G X X X X X X X X X -1123 đến - 1128 Mất đoạn TGATAA X X X X X -1150 C→T X X X X X -1333 G→A X X X X X -1337 A→T X X X X X -1338 A→G X X X X X X X X X -1373 A→C X X X X X X X X X -1391 A→C X -1392 T→C X
Kết quả phân tích các đa hình trong vùng promoter (1406 bp) của gen OsNHX3
cho thấy có 36 vị trí xảy ra sự thay thế nucleotide trong đó kiểu đồng hốn xảy ra ở 25 vị trí và kiểu dị hốn là 11 vị trí. Kiểu thay thế đồng hốn phổ biến nhất là dạng thay thế G bằng A. Ngồi ra vùng promoter gen này cũng có 4 vị trí mất nucleotide và chỉ có 2 vị trí thêm nucleotide (Bảng 3.7). Kết quả phân tích cũng cho thấy 2 giống lúa cƣờm dạng 2 (CD2) và nếp cúc (NC) có trình tự promoter tƣơng đồng với trình tự promoter của cơ sở dữ liệu (Nipponbare).
Mặc dù có nhiều vị trí thay thế nucleotide trong trình tự promoter ở các giống lúa tuy nhiên sự thay thế đó ít dẫn đến sự thay đổi yếu tố điều hịa cis. Phân tích vị trí thay thế nucleotide trong vùng promoter giữa các giống lúa với cơ sở dữ liệu chúng tơi nhận thấy chỉ có 2 vị trí dẫn đến sự thay đổi yếu tố điều hịa cis đó là -1059 và -1095 (so với vị trí ATG). Ở vị trí 1095 yếu tố AAGAA-motif (GGTGAAGAAA) do A đƣợc thay thế
1059 yếu tố I box (CTCTTATGC) do thay thế C bằng T nên đã chuyển thành yếu tố TATA-box (TTTTA). Kết quả cũng ghi nhận sự thay thế nucleotide ở 2 giống lúa NC và CD hầu nhƣ khơng dẫn đến sự thay đổi yếu tố điều hịa cis (Bảng 3.8).
Bảng 3.8 Sự thay đổi yếu tố điều hòa cis do thay thế nucleotide trong vùng promoter gen
OsNHX3 ở 11 giống lúa.
Giống lúa
Vị trí thay thế nucleotide làm thay đổi yếu tố điều hòa cis
-1059 -1095
CD2 Không thay đổi Không đổi
NC Không thay đổi Không đổi
CD1 I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif MD2 I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif MD1 I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif CR I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif CB I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif C I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif TL I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif CĐ I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif PK I box chuyển thành TATA-box AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Từ những kết quả đã đạt đƣợc của đề tài chúng tôi đƣa ra những kết luận sau:
1. Xác định 5 gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa lần lƣợt là OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4 và OsNHX5, trong đó sự tƣơng đồng về cấu trúc giữa các gen từ OsNHX1 đến OsNHX4 là cao hơn so với OsNHX5.
2. Dự đốn đƣợc mơ hình cấu trúc xun màng, cấu trúc bậc 3 bằng phƣơng pháp
in silico và so sánh đƣợc sự sai khác về trình tự amino acid giữa các protein thuộc họ
protein OsNHX. Kết quả so sánh cho thấy các protein từ OsNHX1 đến OsNHX4 có độ tƣơng đồng khá cao (50- 70%), trong khi protein OsNHX5 có mức tƣơng đồng khá thấp so với 4 protein còn lại (~20%).
3. Xác định đƣợc vùng promoter, các yếu tố điều hịa cis liên quan đến tính chịu mặn của các gen thuộc họ gen OsNHX.
4. Đã phân tích đƣợc sự biểu hiện của các gen bằng phƣơng pháp in silico dựa trên dữ liệu sẵn có về sự biểu hiện của gen trong điều kiện bình thƣờng và điều kiện stress mặn. Kết quả phân tích cho thấy trong điều kiện bình thƣờng các gen OsNHX2, OsNHX3
và OsNHX5 biểu hiện mạnh ở nhiều mô, cơ quan trong khi gen OsNHX1 chỉ biểu hiện mạnh nhất ở giai đoạn hình thành mơ phân sinh đỉnh chồi. Trong điều kiện stress mặn các gen OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX5 biểu hiện mạnh ở giai đoạn sinh sản; giai đoạn sinh trƣởng sự biểu hiện các gen khác biệt khơng đáng kể giữa các nhóm đối chứng và xử lý mặn.
5. Nhân bản thành công vùng promoter gen OsNHX3 ở 12 giống lúa và phân tích đƣợc các vị trí đa hình trong vùng promoter gen OsNHX3 ở 11 giống lúa. Trong số 36 vị trí đa hình thì kiểu thay thế đồng hốn chiếm ƣu thế (25/36). Tuy nhiên chỉ có 2 vị trí dẫn đến sự thay đổi yếu tố điều hịa cis đó là vị trí -1059 (I box chuyển thành TATA-box) và - 1095 (AAGAA-motif chuyển thành TCCACCT-motif).
Kiến nghị
Từ những kết quả đạt đƣợc chúng tơi có một số kiến nghị nhƣ sau:
1. Phân tích đa hình vùng mã hóa (Cds) của gen OsNHX3 ở 11 giống lúa. 2. Đánh giá mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-PCR.
3. Phân tích sâu và chi tiết hơn cở sở dữ liệu họ gen OsNHX và tích hợp chúng thành bộ cơ sở dữ liệu gene card.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bùi Chí Bửu, & Nguyễn Thị Lang. (2003). "Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trƣờng của cây lúa". Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
Tiếng Anh
2. Akhiles . T, Jitendrap . K & Saura. (2004, April). “Structural and functional analysis of rice genome”. Journal of Genetics.
3. An R., Chen Q.-J., Chai M.-F., Lu P.-L., Su Z., Qin Z.-X., … Wang X.-C. (2007). "AtNHX8, a member of the monovalent cation: proton antiporter-1 family in Arabidopsis thaliana, encodes a putative Li+/H+ antiporter". The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology, 49(4), pp.718–728.
4. Apse M. P., Sottosanto J. B., & Blumwald E. (2003). "Vacuolar cation/H+ Exchange, ion homeostasis, and leaf development are altered in a T-DNA insertional mutant of AtNHX1, the Arabidopsis vacuolar Na+/H+ antiporter". The Plant Journal: For
Cell and Molecular Biology, 36(2), pp.229–239.
5. Atsunori Fukuda A. N. (2010). "Molecular and functional analyses of rice NHX-type Na+ /H+ antiporter genes.". Planta, 233(1), pp.175–88.
6. Bassil E., Coku A., & Blumwald E. (2012). "Cellular ion homeostasis: emerging roles of intracellular NHX antiporters in plant growth and development". Journal of Experimental Botany, pp.ers250.
7. Bassil E., Ohto M., Esumi T., Tajima H., Zhu Z., Cagnac O., … Blumwald E. (2011). "The Arabidopsis intracellular Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and development". The Plant Cell,
23(1), pp.224–239.
8. Brett C. L., Donowitz M., & Rao R. (2005). "Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers". American Journal of Physiology - Cell Physiology,
288(2), pp.C223–C239.
9. Brett C. L., Tukaye. D., Mukherjee. S., & Rao R. (2005). " The Yeast Endosomal Na+(K+)/H+ Exchanger Nhx1 Regulates Cellular pH to Control Vesicle Trafficking". Molecular Biology of the Cell, 16(3), pp.1396-1405.
10. Brown R. L., Kazan K., McGrath K. C., Maclean D. J., & Manners J. M. (2003). "A Role for the GCC-Box in Jasmonate-Mediated Activation of the PDF1.2 Gene of Arabidopsis". Plant Physiology, 132(2), pp.1020–1032.
11. Chanroj S., Wang G., Venema K., Zhang M. W., Delwiche C. F., & Sze H. (2012). "Conserved and diversified gene families of monovalent cation/H+ antiporters from algae to flowering plants". Plant Physiology, 3, pp.25.
12. Fukuda A., Nakamura A., & Tanaka Y. (1999). "Molecular cloning and expression of the Na+ /H+ exchanger gene in Oryza sativa". Biochimica Et Biophysica Acta,
1446(1-2), pp.149–155.
13. Fukuda A., Nakamura A., Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H., & Tanaka Y. (2004). "Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance
of a vacuolar Na+ /H+ antiporter from rice". Plant and Cell Physiology, 45(2),
pp.146–159.
14. Gálvez F. J., Baghour M., Hao G., Cagnac O., Rodríguez-Rosales M. P., & Venema K. (2012). "Expression of LeNHX isoforms in response to salt stress in salt sensitive and salt tolerant tomato species". Plant physiology and biochemistry: PPB / Sociộtộ franỗaise de physiologie végétale, 51, pp.109–115.
15. Horie T., Karahara I., & Katsuhara M. (2012). "Salinity tolerance mechanisms in glycophytes: An overview with the central focus on rice plants". Rice, 5(1), pp.11. 16. Jiang X., Leidi E. O., & Pardo J. M. (2010). "How do vacuolar NHX Exchangers
function in plant salt tolerance?". Plant Signaling & Behavior, 5(7), pp.792–795. 17. Khush G. S. (1997). "Origin, dispersal, cultivation and variation of rice". Plant
Molecular Biology, 35(1-2), pp.25–34.
18. Komarnytsky. S., & Borisjuk. N. (2003). "Functional analysis of promoter elements in plants". Genetic Engineering, 25, pp.113–141.
19. Kumar K., Kumar M., Kim S.-R., Ryu H., & Cho Y.-G. (2013). "Insights into genomics of salt stress response in". Rice, 6(1), pp.27.
20. Li J., He X., Xu L., Zhou J., Wu P., Shou H., & Zhang F. (2008). "Molecular and functional comparisons of the vacuolar Na+/H+ exchangers originated from glycophytic and halophytic species". Journal of Zhejiang University. Science. B,
21. Londo J. P., Chiang Y.-C., Hung K.-H., Chiang T.-Y., & Schaal B. A. (2006). "Phylogeography of Asian wild rice, Oryza rufipogon, reveals multiple independent domestications of cultivated rice, Oryza sativa". Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(25), pp.9578–9583.
22. M. Akbar, T. Yabuno, & S. Nakao. (1972). “Breeding for Saline-resistant Varieties of Rice”. Japan. J. Breed, 22(5), pp.277-284.
23. Ma Y., Wang J., Zhong Y., Cramer G. R., Cheng Z.-M., & others. (2015). "Genome- wide analysis of the cation/proton antiporter (CPA) super family genes in grapevine (Vitis vinifera L.)". Plant Omics Journal, 8(4), pp. 300-311.
24. Mishra S., Alavilli H., Lee B., Panda S. K., & Sahoo L. (2014). "Cloning and Functional Characterization of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter Gene from Mungbean (VrNHX1) and Its Ectopic Expression Enhanced Salt Tolerance in Arabidopsis thaliana". PLoS ONE, 9(10), pp.e106678.
25. Mudgal V., Madaan N., & Mudgal A. (2010). "Biochemical Mechanisms of Salt Tolerance in Plants: A Review". International Journal of Botany, 6(2), pp.136–
143.
26. Munns R., & Tester M. (2008). "Mechanisms of Salinity Tolerance". Annual Review of Plant Biology, 59(1), pp.651–681.
27. Pardo J. M., Cubero B., Leidi E. O., & Quintero F. J. (2006). "Alkali cation