2.2.1. Tách chiết DNA tổng số bằng phƣơng pháp CTAB :
Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa bằng dung dịch đệm CTAB là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền thực vật. Dựa trên quy trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994) [31], chúng tôi đã điều chỉnh tối ƣu một số bƣớc nhƣ sau:
Ngiền khoảng 2 gam lá lúa trong nitở lỏng thành dạng bột mịn, sau đó chuyển vào ống eppendorf. Cho 500 μl dung dịch đệm 2x CTAB vào ống eppendorf có chứa mẫu lá lúa đã nghiền và ủ ở 65°C trong vòng 15 phút. Chờ nguội, bổ sung 500ml CI (chloroform: isoamylalcohol = 24:1) và trộn đều. Ly tâm 10000v/10p ở 4°C. Thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung thêm isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1. Trộn đều sau đó để trong đá 10 phút. Ly tâm 14000v/5p ở 4°C sau đó loại bỏ dịch pha trên và rửa tủa bằng 500 μl EtOH 700C, ly tâm 14000 vòng / 5 phút ở 4°C. Thu tủa và để khô tủa ở nhiệt độ phịng. Cuối cùng bổ sung 50µl TE buffer để bảo quản.
2.2.2. Phƣơng pháp điện di trên gel Agarose
Mục đích của phƣơng pháp điện di này là để kiểm tra sơ bộ chất lƣợng mẫu DNA tổng số và kiểm tra kích thƣớc sản phẩm PCR so sánh với thang DNA chuẩn .Quy trình
Pha gel agarose loại 1% bằng cách cho 1gram thạch agarose vào trong 100ml đệm TAE, khuấy đều và cho vào lị vi sóng đun nóng sao cho gel tan đều và khơng tạo bọt. Để gel nguội ở khoảng 50-550C rồi đổ gel vào bể điện di có cài sẵn đá lạnh để làm đơng gel, sau đó cắm lƣợc điện di. Sau 15-20 phút gel đơng có thể rút lƣợc ra và đổ đệm TAE1X cao hơn bề mặt gel từ 2-5mm.
Tra các mẫu DNA theo thứ tự ghi sẵn vào các giếng điện đi, đậy nắp bể điện di và cắm điện cực khởi động máy điện di. Tiến hành chạy điện di với dòng điện một chiều khoảng 90V trong 30 phút. Sau khi kết thúc điện di tiến hành soi gel bằng máy chiếu tia UV, quan sát và chụp hình bản gel điện di.
2.2.3. Phƣơng pháp PCR
Để nhân bản vùng promoter gen OsNHX3 chúng tôi đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhƣ bảng 2.2.
Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng PCR vùng promoter gen OsNHX3
Tên mồi Trình tự Tm Kích thƣớc sản phẩm
Pro-NHX3
Fw:GAACACCACCTATGTCTGTACT
Rv:CCACAGAACAAAACTCAAAACC 55 1795bp
Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt đƣợc minh họa ở bảng 2.3 và 2.4.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ V(µl) Thành phần phản ứng Nồng độ V(µl) Khn DNA 50-100ɳg/µl 1,5 dNTPs 2mM 5 Đệm buffer 10X 5 Mồi ngƣợc 10µM 1,5 Mồi xi 10µM 1,5 Tag polymerase 5u 0,3 H2O 35,2 Tổng thể tích 50
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Chu trình nhiệt Thời gian
Biến tính ở 950C 5 phút
Thực hiện 35 chu kỳ
Biến tính ở 940C 30 giây Gắn mồi ở nhiệt độ 550C 30 giây
Kéo dài mạch ở 720
C 1 phút 30 giây Chu kì kéo dài cuối cùng ở 720C 5 phút
Bảo quản mẫu ở 40C + ∞
2.2.4. Sử dụng các cơ sở dữ liệu và phần mềm tin sinh để nghiên cứu in silico gen mã hóa cho protein NHX và phân tích kết quả nghiên cứu hóa cho protein NHX và phân tích kết quả nghiên cứu
Để thu thập dữ liệu về số hiệu locus, trình tự gen, mRNA và protein chúng tơi sử dụng các cơ sở dữ liệu nhƣ NCBI.
Phytozome v10 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) và
RGAP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu). Sử dụng các thuật tốn blast để so sánh trình tự protein, nucleotide từ NCBI với các cơ sở dữ liều Phytozome, RGAP7 để xác định các thành viên trong họ gen OsNHX ở lúa.
Từ dữ liệu về các gen liên quan, phân tích sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide và trình tự acid amin bằng cơng cụ Unipro UGEN (http://ugene.net/).
Dựa trên nguyên lý về đặc điểm trình tự của các yếu tố cis và tính bảo thủ của chúng ở các nhóm lồi thực vật chúng tơi đã tìm kiếm các yếu tố cis trong vùng promoter các gen thuộc họ OsNHX trên database :
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/,
Đối với gen OsNHX4 do khơng có thơng tin về trình tự TSS nên chúng tơi đã sử dụng công cụ xác định vùng promoter dựa trên sự phân tích về năng lƣợng tự do đƣợc tìm thấy trong vùng promoter khi gen tiến hành hoạt động phiên mã (http://www- bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/).
Mơ hình protein xun màng đƣợc xác định bởi các cơ sở dữ liệu
http://wlab.ethz.ch/protter/# và http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl.
Để giải thích mơ hình cấu trúc bậc 3 của họ protein NHX chúng tôi sử dụng cơ sở dữ liệu từ PFAM và chƣơng trình Phyre2.
(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index).
Nguyên lý dự đốn dựa trên việc so sánh trình tự amino acid của protein cần dự đốn với trình tự protein đƣợc xây dựng trong mơ hình gốc. Xác định mức độ tƣơng đồng về trình tự acid amin, xác định các nhóm amino acid ƣa nƣớc, kị nƣớc, tích điện âm hay dƣơng để xây dựng mơ hình.
Tất cả các mơ hình 3D của họ protein OsNHX ở lúa đƣợc đánh giá định lƣợng bằng các chƣơng trình ProSA-web ( https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php) và VADAR ver1.8 (http://vadar.wishartlab.com/).
Chƣơng trình VADAR ver1.8 dùng để đánh giá chất lƣợng mơ hình 3D protein. Nếu kết quả phân tích chỉ số Ramachandran cho thấy có ít nhất 90% gốc amino acid nằm trong vùng lõi thì mơ hình protein đó đƣợc đánh giá đạt yêu cầu về mặt hóa lập thể của cấu trúc đó (stereochemical quality).
Dữ liệu về biểu hiện các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa đƣợc phân tích in silico bằng một số công cụ online nhƣ: http://www.ricearray.org/ , http://signal.salk.edu/cgi- bin/RiceGE .
Sử dụng cơng cụ so sánh trình tự promoter (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ ) để rút ra sự sai khác về trình tự promoter của các giống lúa nghiên cứu.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu in silico họ gen OsNHX
3.1.1. Dữ liệu về họ gen OsNHX
Dựa trên dẫn liệu cây phát sinh chủng loại và chức năng phân tử protein ngƣời ta đã xác định đƣợc rằng họ gen NHX ở thực vật là một thành viên thuộc nhóm 1 (CPA1)
của siêu họ gen mã hóa protein vận chuyển ion/proton (CPA). Siêu họ gen này có mặt ở hầu hết các nhóm sinh vật từ đơn bào cho đến những sinh vật bậc cao [30].
Họ gen OsNHX đƣợc xác định dựa trên cơ sở Blast, so sánh các trình tự protein, mRNA từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ NCBI, rice Phytozome v10, RGAP7, RAPdb…Phân tích kết quả chúng tơi đã xác định đƣợc họ gen OsNHX ở lúa gồm 5 gen thành viên là OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4 và OsNHX5 (Bảng 3.1). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của một số tác giả khác [5], [30].
Bảng 3.1 Thông tin về cơ sở dữ liệu các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa
Các gen Số hiệu locus trên NCBI
Số hiệu locus trên RGAP7 Kích thƣớc gen (bp)
OsNHX1 AB021878 LOC_Os07g47100 4924
OsNHX2 AB531435 LOC_Os11g42790 4105
OsNHX3 AB531433 LOC_Os05g05590 6188
OsNHX4 NM_001187824 LOC_Os06g21360 4280
OsNHX5 AB531434 LOC_Os09g11450 10171
3.1.1.1. Vị trí phân bố các gen trên NST
Vị trí phân bố locus các gen của họ gen OsNHX đƣợc mô phỏng bằng công cụ
Chromosome Map Tool (http://viewer.shigen.info/oryzavw/maptool/MapTool.do). Theo đóOsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4, OsNHX5 lần lƣợt phân bố trên các NST số 7, 11, 5, 6, và 9 (hình 3.1). Trong đó các gen OsNHX1và OsNHX4 nằm trên NST sợi (+),
Hình 3.1 Sơ đồ phân bố các gen OsNHX trên NST ở lúa 3.1.1.2. Cấu trúc của các gen thuộc họ gen NHX 3.1.1.2. Cấu trúc của các gen thuộc họ gen NHX
Sơ đồ tổ chức các gen thuộc họ gen NHX đƣợc mơ phỏng dựa trên kích thƣớc gen, số lƣợng các exon/intron và thông tin về vùng 5’UTR, 3’UTR của mỗi gen đƣợc xử lý từ nhiều nguồn dữ liệu khác nhau nhƣ RAGP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu),
Phytozome v10.2 database (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) và PIECE database (http://wheat.pw.usda.gov/piece/index.php).
So sánh cấu trúc của 5 gen thuộc họ gen OsNHX chúng tôi ghi nhận các gen OsNHX1 và OsNHX3 có cùng số Exon/Intron (14 exon), trong khi đó cả 2 gen OsNHX2
và OsNHX4 đều chứa 13 exon. Sự khác biệt này là do exon số 5 (242bp) ở gen OsNHX2 đƣợc phân tách thành 2 exon với kích thƣớc nhỏ hơn (47bp và 195bp) có mặt ở các gen
khác biệt với 4 gen cịn lại. Phân tích kích thƣớc và vị trí mỗi exon các gen từ OsNHX1 đến OsNHX4 cho thấy chúng có nhiều điểm tƣơng đồng khi có đến 7 exon giống nhau về kích thƣớc và trật tự phân bố. Thậm chí hai gen OsNHX1 và OsNHX3 có độ tƣơng đồng cao hơn khi có 12/14 exon giống nhau. Sự giống nhau giữa 12 exon này chứng tỏ chúng có tính bảo thủ cao trong q trình tiến hóa. Vùng 5’UTR của mỗi gen có cấu trúc khác nhau có thể liên quan đến mức độ biểu hiện của gen (Hình 3.2).
Hình 3.2 Cấu trúc exon/intron các gen thuộc họ gen NHX ở lúa
So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide các gen thuộc họ gen OsNHX chúng tôi cũng nhận thấy các gen OsNHX1 và OsNHX2; OsNHX2 và OsNHX3 có mức độ
tƣơng đồng cao nhất 52%). Trong khi gen OsNHX5 có mức độ tƣơng đồng thấp so với
các gen OsNHX1, OsNHX2 và OsNHX3 (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotid các gen thuộc họ OsNHX
Độ tƣơng đồng
Nucleotid (%) OsNHX5 OsNHX4 OsNHX3 OsNHX2 OsNHX1
OsNHX5 x 50 42 49 45 OsNHX4 50 x 46 44 44 OsNHX3 42 46 x 52 47 OsNHX2 49 44 52 x 52 OsNHX1 45 44 47 52 x Kích thƣớc gen (bp) 10377 4280 6144 4105 4924
Nhìn chung các gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa có kích thƣớc dao động từ 4-11kb. Các gen từ OsNHX1 đến OsNHX4 có đặc điểm tƣơng tự nhau về số lƣợng, cấu trúc và vị trí phân bố các exon/intron đồng thời chúng cũng khác biệt rất lớn so với gen OsNHX5.
Phân tích đặc điểm cấu trúc các gen có vai trị quan trọng trong việc xác định nguồn gốc tiến hóa của họ gen và nghiên cứu sự đáp ứng đặc hiệu của gen đối với các điều kiện stress từ ngoại cảnh.
3.1.1.3. Phân tích cấu trúc của protein
a) So sánh trình tự amino acid đƣợc mã hóa bởi các gen thuộc họ gen OsNHX
Trình tự amino acid của đƣợc mã hóa bởi 5 gen thuộc họ gen OsNHX ở lúa đƣợc thu thập và xử lý từ cở sở dữ liệu RAGP7 (http://rice.plantbiology.msu.edu) và
Phytozome v10.2 database (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). Qua phân tích dữ liệu cho thấy, protein thuộc họ gen OsNHX có số amino acid vào khoảng từ 528 đến 549 với mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid dao động từ 19,75% đến 72,61%. Các protein OsNHX1 đến OsNHX3 có độ tƣơng đồng cao nhất (>70%), trong khi protein
OsNHX5 có độ tƣơng đồng thấp nhất khi so sánh với 4 protein còn lại (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid các protein họ OsNHX
protein (%) OsNHX5 x 21.193 19.749 20.57 20.382 OsNHX4 21.193 x 51.872 50.799 52.151 OsNHX3 19.749 51.872 x 71.245 70.26 OsNHX2 20.57 50.799 71.245 x 72.61 OsNHX1 20.382 52.151 70.26 72.61 x Kích thƣớc protein (aa) 549 528 544 545 535
b) Dự đoán cấu trúc xuyên màng các phân tử protein thuộc họ protein OsNHX
Cấu trúc bậc 2 của các protein OsNHX đƣợc biểu thị dƣới các dạng xoắn, các miền xuyên màng, miền bên trong hay bên ngồi bào quan và những miền có chức năng quan trọng. Sử dụng một số cơ sở dữ liệu dự đốn mơ hình cấu trúc protein nhƣ, FFAS03, SWISS-MODEL và Phyre2 chúng tôi đã xác định rằng các protein OsNHX đƣợc giải thích dựa mơ hình mẫu (c4cz8A) cấu trúc tinh thể protein PaNhaP của vi khuẩn
Pyrococcus abyssii. Kết quả phân tích này cũng phù hợp với dữ liệu từ Pfam cho phép
chúng tôi khẳng định họ protein PaNhaP ở vi khuẩn và họ protein OsNHX có điểm chung về nguồn gốc phát sinh chủng loại. Xác định các miền protein xuyên màng họ protein OsNHX bằng công cụ mô phỏng cấu trúc protein tại http://wlab.ethz.ch/protter/# và http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl. Kết quả mô phỏng cho biết protein OsNHX1,
OsNHX3và OsNHX2 (Hình 3.3a, 3b và 3.3c) đều có 12 miền xuyên màng. Mặc dù Protein OsNHX4 và OsNHX5 đều có 11 miền xuyên màng tuy nhiên chúng lại khác biệt nhau rõ rệt về mặt cấu trúc (3.3d và 3.3e). Trong 5 phân tử protein chỉ có protein OsNHX5 là có tín hiệu peptid ở đầu N (Hình 3.3e). Kiểu dạng hình học các protein OsNHX1 và OsNHX3 cho thấy sự giống nhau rõ rệt về sự sắp xếp trật tự các miền xuyên màng, trong màng, ngồi màng và cả vị trí xảy ra sự N-glyco hóa.
Hình 3.3a Mơ hình cấu trúc các miền protein xun màng OsNHX1
Hình 3.3c Mơ hình cấu các miền protein xuyên màng OsNHX3
Hình 3.3e Mơ hình cấu trúc các miền protein xuyên màng OsNHX5
Hình 3.3a đến 3.3c (OsNHX1 đến OsNHX3) cho thấy chúng đều có 12 miền xuyên màng chứng tỏ chúng đƣợc xếp cùng nhóm chức năng đó là trao đổi Na+
/H+ ở màng khơng bào. Mặc dù protein OsNHX4 có 11 miền protein nhƣng những miền quan trọng nhƣ miền 3, 6, 7 đều giống với các miền 3,6,7 của các protein OsNHX1, OsNHX2 và OsNHX3. Do đó các protein OsNHX1 đến OsNHX 4 đều thực hiện chức năng ở màng khơng bào. Riêng OsNHX5 (hình 3.3e) có tín hiệu peptid ở đầu N và có các miền 3,6,7 khác với 4 protein cịn lại. Do đó OsNHX5 trao đổi Na+/H+ ở màng hệ Gônghi.
Khả năng hoạt động của các antiporter NHX nói chung đƣợc kiểm sốt bởi một vị trí bám đặc hiệu bởi phân tử amiloride tại miền TM3 của hầu hết các protein tƣơng đồng
họ NHX. Vị trí này có trình tự đặc trƣng là LFFIYLLPPI, có tính bảo thủ cao và ảnh hƣởng đến khả năng kìm hãm hoạt động các antiporter [24], [38].
Mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid và kiểu dạng hình học cấu trúc protein cũng thể hiện sự khác biệt giữa các miền. Đầu N có sự tƣơng đồng cao hơn trong khi đầu C có sự tƣơng đồng thấp hơn đặc biệt là các vị trí sau miền TM12 trở đi.
c) Dự đoán cấu trúc bậc 3 các phân tử protein thuộc họ gen OsNHX
Để xác định mơ hình cấu trúc bậc 3 họ protein NHX chúng tôi tiến hành alignment trình tự acid amin của các protein từ OsNHX1 đến OsNHX5 với các cơ sở dữ liệu FFAS03, SWISS-MODEL và PFAM. Phân tích mơ hình protein từ Phyre2 kết hợp với so sánh với các cơ sở dữ liệu trên, chúng tôi đã định xác rằng mơ hình cấu trúc bậc 3 protein OsNHX đƣợc giải thích dựa mơ hình mẫu (c4cz8A) cấu trúc tinh thể protein
PaNhaP của vi khuẩn Pyrococcus abyssii. Kết quả phân tích cho thấy mơ hình 3D protein từ OsNHX1 đến OsNHX5 có mức độ tƣơng đồng với mơ hình gốc (c4cz8A) lần lƣợt là: 23%, 22%, 23%, 19% và 21% (các hình 3.4a, 3.4b, 3.4c, 3.4d và 3.4e).
Hình 3.4c Mơ hình 3D protein OsNHX3 Hình 3.4d Mơ hình 3D protein OsNHX4
Hình 3.4e Mơ hình 3D protein OsNHX5
d) Đánh giá mơ hình cấu trúc 3D của các protein thuộc họ protein OsNHX ở lúa
Mơ hình 3D các phân tử protein thuộc họ OsNHX đƣợc phân tích định lƣợng bằng các chƣơng trình nhƣ ProSA-web và VADAR ver1.8. Đánh giá cơ sở dữ liệu các protein OsNHX bằng cách tính tốn chỉ số Z-score của mỗi mơ hình protein 3D OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX4 và OsNHX5 so sánh với mơ hình mẫu (Phụ lục 1).
Kết quả đánh giá định lƣợng cơ sở dữ liệu bằng ProSA cho thấy protein OsNHX1 có giá trị Z-score là -3.7 gần với giá trị của mơ hình mẫu c4cz8A (Z-score là -4.68). Các protein
cịn lại có giá trị thấp hơn đặc biệt là protein OsNHX4 có giá trị Z-score khá thấp. Do đó để đánh giá mức độ tin cậy của các mơ hình 3D protein OsNHX chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phân tích điểm Ramachandran.
Kết quả phân tích điểm Ramachandran bằng chƣơng trình VADAR ver.1.8 đƣợc thể hiện ở hình 3.5 và các hình 7, 8, 9, 10 ở phụ lục 1. Biểu đồ điểm (plot) cho thấy vị trí phân bố các gốc amino acid tại hai miền góc xoắn (torsion angles) là Phi (Φ) and Psi (Ψ), ngoại trừ các amino acid phân bố tại đầu cuối mỗi chuỗi polipeptid. Gốc glycine đƣợc