3.1 Kết quả nghiên cứu in silico họ gen OsNHX
3.1.2 Phân tích vùng promoter các gen thuộc họ gen OsNHX
3.1.2.1. Nhận diện các yếu tố cis thuộc vùng promoter
Vùng lõi promoter của mỗi gen đƣợc xác định có vị trí xung quanh TSS vào khoảng +/-50 nucleotid. Trong vùng lõi, nhiều yếu tố quan trọng nhƣ TATA box, G box, CAAT box góp phần điều hịa hoạt động phiên mã của gen. Theo dữ liệu đƣợc cập nhật tại trang: http://grassius.org/tf_browsefamily.html?species=Rice, có ít nhất 1772 yếu tố
phiên mã đã đƣợc tìm thấy ở hệ gen của tất cả các loài lúa thuộc chi Ozyza sativa. Kết
quả tìm kiếm các yếu tố cis đƣợc thống kê ở phụ lục 2 cũng cho thấy có rất nhiều yếu tố điều hòa Cis trong vùng promoter của 5 gen OsNHX. Tuy nhiên chúng tơi chỉ phân tích một số yếu tố vùng lõi và các yếu tố có ảnh hƣởng đến cƣờng độ phiên mã và mức độ biểu hiện tính chịu mặn và chịu hạn của các gen nhƣ hộp TATA, CAAT, ABRE, GT1GMSCAM4, MBS, NAC, W-box, GCN4-motif, DRE, MYBCORE. Các yếu tố đƣợc đánh dấu (*) thể hiện kết quả tìm kiếm từ PLACE plant Database. Yếu tố phiên mã NAC đƣợc tìm kiếm từ cơ sở dữ liệu http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/.
Để có dữ liệu thơng tin về vị trí hộp TATA, trình tự TSS và một số yếu tố cis quan trọng chúng tơi có tham khảo kết quả nghiên cứu của tác giả Atsunori Fukuda đăng trên tạp chí springer tháng 1 năm 2011 [5]. Theo tác giả vị trí trình tự TSS của các gen
OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX5 lần lƣợt là: -313, -406, -538 và -150 so với vị trí ATG.
Dựa và trình tự TSS kết hợp với cơng cụ trực tuyến tại trang web chúng tôi tiến hành tìm kiếm các yếu tố cis và kết quả đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.5.
Bảng 3.5 Vị trí trình tự TSS và các yếu tố cis vùng promoter các gen thuộc họ OsNHX
Gene Promoter
OsNHX1 OsNHX2 OsNHX3 OsNHX5
Vùng lõi
TATA box
-36 TATA
-20
TACAAAA Khơng có Khơng có
CAAT
-168 CAAAT
+29
CAAAT Khơng có Khơng có
G-Box -81 CACGTG -116 CACGTG -102, +13 CACGAC CACATGG Khơng có Y-Patch -47, -48, -49 CCTCCC CCCTCC -32, -33, -34 CCTCCT CCCTCC -14, -21,+37 TTTCTC CCCTCC -34, +15 +26 TTCTTC TTCCCC Stress mặn ABRE -81(-), -79 ACGTGGC -115, -118(-) -140 ACGTGGC CGGTGCA -219 ACGTCGGC Khơng có MBS -657 (-) CAACTG -868, -918 (T/C)AACTG -62(-) CGGTCAA -308,-472(-) TAACTG NAC -1145, -977(-) CAGTCAAAT GCTTGACTT +44 (-),-786(-) - 787(-),-788(-) CAATCATTA GATGCGTTTAG -37 TTTTCGTTA -940, -934(-) -464(-) AAGTCAATT TTAACTGAC ATAACTGGC
Ghi chú : * Các yếu tố được đánh dấu (*) thể hiện kết quả tìm kiếm từ PLACE plant Database;
Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5 cho thấy hầu hết vị trí TSS của các gen đều nằm gần sát vùng 5’UTR, cá biệt có gen nằm sâu vào khoảng 70 nucleotid nhƣ gen OsNHX5. Đặc điểm về trình tự TSS cũng cho thấy một quy luật đặc thù đó là quy luật Y/R. Ngƣời ta quy ƣớc nucleotide vị trí + 1 là vị trí TSS, kế đó vị trí -1 là nuleotid đầu tiên của trình tự ngƣợc dịng TSS. Nhƣ vậy theo quy luật này TSS (-1/+1) sẽ có dạng Y/R (-1/+1). Trong đó Y là các base pyrimidine, cịn R là các base Purine.
W-box -167, -747 TTGAC -745, -167 TTGAC -61, -789(-) TTGACC -473,-724(-) TTGACC GCN4-motif -290 TGTGTCA
Khơng có Khơng có Khơng có
Stress hạn ABRE -81(-), -79 ACGTGGC -115, -118(-) -140 ACGTGGC CGGTGCA -219 ACGTCGGC Khơng có MBS -657 (-) CAACTG -868, -918 (T/C)AACTG -62(-) CGGTCAA -308,-472(-) TAACTG DRE (*) -326 ACCGAGA Khơng có -216(-) ACCGAC - 1226 ACCGAC MYBCORE (*) -970 CNGTTR -967(-) -867(-) CNGTTR -727 CNGTTR -750,-305 -308(-) CNGTTR NAC -1145, -977(-) CAGTCAAAT GCTTGACTT +44 (-),-786(-) - 787(-),-788(-) CAATCATTA GATGCGTTTAG -37 TTTTCGTTA -940, -934(-) -464(-) AAGTCAATT TTAACTGAC ATAACTGGC
Một yếu tố khác cũng vô cùng quan trọng đó là TATA-box. Nó vừa nằm trong trình tự lõi của promoter vừa có vai trị tăng cƣờng sự biểu hiện của gen. Trong bốn gen đã biết thơng tin về TSS thì có hai gen OsNHX3, OsNHX5 khơng có hộp TATA và các
yếu tố cis quan trọng của vùng lõi nhƣ CAAT, G box. Mặc dù hộp TATA rất quan trọng cho sự hình thành phức hệ khởi đầu phiên mã và kiểm sốt phiên mã song khơng phải hệ gen thực vật nào cũng có hộp TATA trong vùng promoter. Theo tác giả P. Civáň, và M. Švecchỉ khoảng 19% hệ gen lúa có chứa hộp TATA, trong khi đó có ít nhất 50% hệ gen lúa có chứa yếu tố Y patch trong vùng lõi promoter. Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 cũng cho thấy hầu hết các gen đều có yếu tố Y patch trong vùng promoter, tuy nhiên có điều đặc biệt là hai gen OsNHX3 và OsNHX5 có khá nhiều yếu tố Y patch xuất hiện gần sát với vị trí TSS. Việc nhiều yếu tố TSS xuất hiện ở gần TSS cho thấy khả năng chúng liên quan đến hoạt động phiên mã khi mà promoter vắng mặt TATA- box.
So sánh các yếu tố cis ta có thể nhận thấy yếu tố CAAT ở gen OsNHX2 và gen
OsNHX2 xuất hiện cao hơn so với những gen khác, trong khi gen OsNHX4 (Xem phụ
lục) có yếu tố này thấp hơn trong khi đó gen OsNHX3 và OsNHX5 gần nhƣ khơng có
CAAT box trong vùng lõi promoter.. Yếu tố CAAT đóng vai trị tăng cƣờng hoạt động phiên mã khi nó nằm càng gần trình tự TSS của gen do đó chúng tơi đề xuất hoạt động phiên mã ở gen OsNHX1 và OsNHX2 diễn ra mạnh mẽ hơn những gen khác khi chịu áp lực stress.
Một số yếu tố tham gia gián tiếp vào đáp ứng stress mặn cũng đƣợc tìm thấy trong vùng promoter của các gen OsNHX nhƣ HSE, LTR và W-box. Các yếu tố này tham gia
phối hợp vào những quá trình đáp ứng stress mặn, lạnh hay điều kiện khô hạn. Gen
OsNHX5 mặc dù khơng có hộp TATA nhƣng lại có mặt cả hai yếu tố liên quan đến stress
nhiệt độ đó là LTR và HSE.
Thực vật có nhiều chiến lƣợc thích nghi với các yếu tố bất lợi từ môi trƣờng nhƣ stress mặn, hạn lạnh, nhiệt…Quá trình đáp ứng thích nghi với các stress chủ yếu đƣợc thực hiện bởi các phytohormone trong đó quan trọng nhất là acid abscisic (ABA). Hoạt động đáp ứng stress diễn ra thông qua con đƣờng phụ thuộc Acid abscisic cần có sự tham
gia của 2 yếu tố điều hịa cis đó là MBS và ABRE. Kết quả phân tích cho thấy các gen
OsNHX1 và OsNHX2 có xu hƣớng biểu hiện tính chịu mặn, chịu hạn thơng qua hoạt động
của yếu tố ABRE còn các gen OsNHX4 và OsNHX5 có tần xuất xuất hiện các yếu tố
MBS cao hơn do đó chúng có xu hƣớng biểu hiện tính chịu mặn thơng qua con đƣờng tổng hợp các hợp chất protein, acid amin tăng cƣờng áp suất thẩm thấp. Theo Gómez- Porras (Gómez-Porras, 2007) yếu tố ABRE có rất nhiều bản sao do đó có thể dùng để đánh giá định lƣợng khả năng đáp ứng stress.
Trong năm thành viên của họ gen OsNHX, chúng tôi nhận thấy gen OsNHX4 thiếu khá nhiều thông tin đặc biệt là các thông tin về vùng promoter và dữ liệu biểu hiện gen. Riêng phần promoter do khơng có thơng tin về trình tự TSS nên chúng tơi đã sử dụng cơng cụ dự đốn vùng promoter Promoter Scan Version 1.7 đƣợc phát triển bởi Dan S. Prestridge, 1995 (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/).
Vùng promoter gen OsNHX4 đƣợc xác định bằng chƣơng trình Promoter Scan có vị trí từ -129 đến -379. Sử dụng chƣơng trình Plan Care để tìm kiếm các yếu tố thuộc vùng lõi promoter gen OsNHX4 chúng tơi dự đốn hộp TATA ở -217 (ATATAT),
CAAT- box (CAAAT, -298) và G box (CACGTG,-274). Tuy nhiên để xác định chính xác vùng promoter của gen này cần phải dựa trên kết quả giải trình tự full-length cDNAs thực nghiệm bằng phƣơng pháp giải trình tự 5' RACE-PCR.
3.1.2.2. Thiết kế logo motif của một số yếu tố cis liên quan đến tính chịu mặn
Logo motif đƣợc thiết kế dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự consensus một số yếu tố cis quan trọng thuộc vùng lõi promoter và các yếu tố cis liên quan đến tính chịu mặn ở nhiều lồi thực vật nhƣ lúa, ngô, cà chua, đậu nành, Arabidopsis…
Từ dữ liệu về trình tự một số yếu tố cis nhƣ ABRE, TATA-box, G-box, MYB, CAAT-box …chúng tôi thiết kế logo biểu hiện mức độ bảo thủ của các trình tự này tại trang web http://biogenio.com/logo/logo.cgi. Logo đƣợc biểu thị bằng chuỗi trình tự màu sắc các nucleotid và đánh số theo vị trí. Trục tung đƣợc biểu thị bằng đơn vị bit, độ rộng hay hàm lƣợng thơng tin. Trục hồnh là vị trí trình tự các chữ cái. Mức độ bảo thủ các
yếu tố cis đƣợc đánh giá bởi giá trị bit (0, 1, 2). Yếu tố có độ rộng càng cao và xuất hiện duy nhất tại vị trí đó thì chứng tỏ nó càng bảo thủ.
ABRE (ABA-responsive element) là yếu tố cis có motif PyACGTGG/TC, đƣợc tìm thấy trong vùng promoter của các gen cảm ứng với ABA. Yếu tố ABRE tham gia điều hịa q trình chống chịu mặn và chịu hạn ở thực vật nhờ con đƣờng tín hiệu phụ thuộc acid abscisic (Bray, 1994; Giraudat và cộng sự 1994; Busk và Page`s, 1998).Kết
quả phân tích cho thấy hai yếu tố ABRE và G-box có trình tự lõi ACGT (hình 3.6 và 3.7).
Hình 3.6 Logo consensus yếu tố ABRE Hình 3.7 Logo consensus yếu tố G-box
MYB là họ yếu tố phiên mã đƣợc tìm thấy ở cả động vật và thực vật. MYB cũng tham gia vào con đƣờng truyền tín hiệu phụ thuộc acid abscisic, tăng cƣờng khả năng chống chịu stress. Họ protein MYB rất đa dạng, ngƣời ta xác định đƣợc ở Arabidopsis có 198 gen mã hóa protein và ở lúa là 183 gen (Yanhui và cộng sự, 2006). Ở lúa gen OsMYB3R-2 đƣợc chuyển vào thực vật cho thấy khả năng chống chịu mặn, hạn và lạnh (Dai và cộng sự, 2007).
Yếu tố cis MBS đƣợc nhân biết bởi trình tự TAACTG (hình 3.8). Logo các yếu tố CAAT, TATA- box và GCN4-motif đƣợc thể hiện ở 3.9, 3.10 và 3.11.
Hình 3.10 Logo consensus yếu tố TATA-box Hình 3.11 Logo consensus yếu tố GCN4
3.1.3. Phân tích in silico dữ liệu biểu hiện các gen OsNHX
Để nghiên cứu sự biểu hiện của các gen OsNHX chúng tôi sử dụng dữ liệu Rice
Oligonucleotide Array Database (ROAD) đã có trên trang web http://www.ricearray.org/ Từ những dữ liệu này chúng tơi phân tích theo hai hƣớng:
i) Phân tích họ gen OsNHX trong điều kiện bình thƣờng.
ii) Phân tích sự đồng biểu hiện của các gen trong họ OsNHX trong điều kiện stress.
3.1.3.1 Sự biểu hiện của các gen thuộc họ gen OsNHX trong điều kiện bình thƣờng
Tại trang web http://www.ricearray.org/, chúng tôi lựa chọn chƣơng trình phân
tích tích hợp (meta analysis) nhiều chƣơng trình, nhiều thí nghiệm có q trình hậu kiểm để đánh giá toàn diện sự biểu hiện các gen OsNHX ở những mô, cơ quan khác nhau qua mỗi giai đoạn phát triển. Kết quả phân tích gen thuộc họ gen OsNHX đƣợc thể hiện hình ảnh và thang biểu đồ nhiệt nhƣ hình 3.12a và 3.12b.
Mặc dù cơ sở dữ liệu tại trang web http://www.ricearray.org/ là khá đầy đủ nhƣng chúng tơi đã khơng tìm thấy dữ liệu của gen OsNHX4 (LOC_Os06g21360). Một số trang web dƣới đây đã đƣợc chúng tôi sử dụng để tìm kiếm thơng tin về sự biểu hiện của gen
OsNHX4 nhƣng cũng khơng có kết quả hoặc kết quả rất nghèo nàn.
http://www.plexdb.org//modules/PD_general/atlas.php
http://bioinf.mind.meiji.ac.jp/Rice_network_public/script/index.html http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500
Kết quả biểu thị ở hình 3.12a cho thấy các gen OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX5
biểu hiện mạnh ở nhiều mô, cơ quan trong khi gen OsNHX1 chỉ biểu hiện mạnh nhất ở giai đoạn hình thành mơ phân sinh đỉnh chồi SAM (Shoot Apical Meristem), biểu hiện yếu nhất tại các tế bào nhu mơ tủy-lóng (internode pith parenchyma) và biểu hiện tƣơng
đối ổn định ở các giai đoạn hình thành phơi, nội bì, hạt và các cơ quan sinh sản, nhụy,nhị, noãn. Gen OsNHX5 biểu hiện cơ định ở hầu hết các mô, cơ quan. Ghi nhận kết quả phân tích gen OsNHX3 chúng tôi thấy sự biểu hiện của gen này mạnh mẽ tại các cơ quan sinh dƣỡng nhƣ rễ, thân, lá chồi, song lại biểu hiện khá yếu ớt tại các thành phần cơ quan sinh sản nhƣ nhụy nhị, noãn và đặc biệt thấp nhất tại nội bì nhƣ 3.12a.
Hình 3.12a. Sự biểu hiện của gen OsNHX tại các mô cơ quan ở lúa
(Đƣợc phân tích từ cở sở dữ liệu: http://www.ricearray.org/)
Sự biểu hiện các gen OsNHX (Hình 3.12b) ở các giai đoạn phát triển cũng thể hiện khác nhau rõ rệt. Phân tích cụ thể tại các giai đoạn phát triển chúng tôi thấy gen OsNHX1 biểu hiện mạnh nhất ở thời kỳ gié 1, gié 2, gié 3, gié 4 và gié 6; các giai đoạn phát triển hạt 1 và 2 còn biểu hiện yếu nhất tại giai đoạn tiền nảy mầm (pregemination)
Đối với gen OsNHX2 chúng tơi cũng phân tích tƣơng tự nhƣ với gen OsNHX1.
Về tổng thể, kết quả phân tích cho thấy sự biểu hiện của gen này là khá mạnh và không đồng đều ở các mơ cơ quan khác nhau. Theo đó gen OsNHX2 biểu hiện ở toàn bộ các
lóng và nhu mơ lóng, đặc biệt biểu hiện mạnh nhất ở giai đoạn đẻ nhánh (tillering). Tuy nhiên sự biểu hiện của gen OsNHX2 lại biểu hiện rất yếu ở đầu rễ nhƣ hình 3.12b.
Hình 3.12b Biểu hiện gen các gen OsNHX qua các giai đoạn phát triển của lúa
(Đƣợc phân tích từ cở sở dữ liệu: http://www.ricearray.org/)
Kết quả phân tích cho thấy gen OsNHX3 biểu hiện rất yếu ở giai đoạn tiền này
mầm trong khi ở giai đoạn 1 lá, 2 lá, 3 lá và giai đoạn đẻ nhánh gen này biểu hiện rất mạnh mẽ nhƣ hình 3.12b. Gen OsNHX5 biểu hiện ổn định qua các giai đoạn phát triển. Sau khi phân tích kết quả của từng gen, chúng tơi tiến hành đánh giá tổng hợp sự biểu hiện các gen bẳng biểu đồ nhiệt đối với 4 gen OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX5, kết quả đánh giá tổng hợp về dữ liệu 4 gen trên đƣợc trình bày ở phụ lục 3.
Riêng với gen OsNHX4 chúng tôi sử dụng cơ sở dữ liệu về biểu hiện gen ở một số trang web nhƣ http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500 và NCBI :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi?ORG=Os&CID=80438
Với những dữ liệu trên Gen OsNHX4 đều đƣợc tra cứu bằng locus Os06G0318500 hoặc
Q5ZA11ở(http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500).
Theo dữ liệu ở NCBI gen OsNHX4 biểu hiện một cách hạn chế ở mô phân sinh
sinh dƣỡng. Kết quả phân tích các trình tự biểu hiện (EST) ở một số mô nhƣ rễ, mô sẹo, mô phân sinh (Bảng 3.6).
Bảng 3.6 Dữ liệu tạo dòng cDNA biểu hiện gen OsNHX4
Dữ liệu biểu hiện gen OsNHX4 tại http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500 cho
thấy sự biểu hiện gen này tại các mô, cơ quan biểu hiện một cách khá hạn chế và hầu nhƣ chỉ biểu hiện mạnh ở giai đoạn phơi. Nhìn chung dữ liệu về sự biểu hiện của gen
OsNHX4 đối với điều kiện stress vẫn chƣa đƣợc tìm thấy (Hình 3.13).
Hình 3.13 Sự biểu hiện của gen OsNHX4 ở một số mơ, cơ quan lúa (Đƣợc phân tích từ
nguồn : http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/OS06G0318500).
3.1.3.2. Sự biểu hiện các gen thuộc họ OsNHX trong điều kiện stress
Phân tích sự biểu hiện các gen OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3, OsNHX5 bằng công cụ http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE trong điều kiện mặn. Các nhóm mẫu đƣợc tiến
hành phân tích bao gồm: GSE4438 và GSE3053. Gen OsNHX1 đƣợc phân tích in silico
với probe ID: Os.4700.1.S1_at. Các gen OsNHX2, OsNHX3 và OsNHX5 có ID lần lƣợt là:Os.14813.1.S1_at;Os.27479.1.S1_at và Os.5237.1.S1_at.
Phân tích dữ liệu in silico các gen OsNHX1, OsNHX2 và OsNHX5 chúng tôi nhận thấy ở giai đoạn sinh trƣởng, sự khác biệt về biểu hiện gen giữa nhóm đối chứng và nhóm xử lú mặn là tƣơng đối nhỏ. Trong khi ở giai đoạn sinh sản mức độ biểu hiện giữa 2 nhóm này là khá rõ nét. Điều này chứng tỏ mặn ảnh hƣởng khá mạnh mẽ đến giai đoạn sinh sản của cây lúa (Hình 3.14). Ở giai đoạn sinh sản, kết quả phân tích cũng ghi nhận các gen OsNHX2 và OsNHX3 đều biểu hiện khá mạnh mẽ của trên giống FL478 (chịu