Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS

Đường D-glucose (EU-G7) được sấy 105°C trong 2h. Cân 0.5g glucose hòa với 40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến đụng 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20C).

Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml.

Tiến hành dựng đường chuẩn:

- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường.

- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6 ml DNS. Phản ứng màu ở 100oC trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.

- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm. Dựng được đường chuẩn y = ax + b

 Tiến hành

Mẫu thí nghiệm:

- Cho vào Eppendorf khoảng 10-11 mg giấy lọc (5 mảnh giấy lọc) và 0.2 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, giữ 50°C trong 5 phút.

- Bổ sung vào Eppendorf chứa cơ chất 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỉ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C chính xác trong 60 phút.

- Bổ sung ngay 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.

- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm

Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên dịch enzyme đã bị bất hoạt (đun sôi enzyme trong 10 phút).

Mẫu đối chứng dương: (dùng enzyme thương phẩm) phân tích 1 mẫu Novozymes 50013 pha lỗng tới 500-1000 lần.

Hoạt tính cellulase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân giấy lọc trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.