CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS
Cơ chất:
- CMCase: CMC 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh
trùng 121˚C trong 15 phút, bảo quản ở 4˚C.
- Xylanase: xylan 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh
trùng 121°C trong 15 phút, bảo quản ở 4°C.
Đường chuẩn
Đường D-glucose (EU–G7) cho CMCase và D-xylose cho xylanase được sấy 105˚C trong 2h. Cân 0.5g đường hòa với 40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch
stock 10mg/ml (bảo quản -20°C).
Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml. Tiến hành dựng đường chuẩn:
- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường.
- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6ml DNS, phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm. Dựng được đường chuẩn: y = ax + b
Tiến hành Mẫu thí nghiệm:
- Hút 0.2 ml cơ chất vào eppendorf, giữ ở 50˚C trong 5 phút.
- Bổ sung 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm.
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên dịch enzyme bị bất hoạt (trước khi phản ứng đun sôi enzyme trong 10 phút).
Mẫu đối chứng dương: phân tích 1 mẫu enzyme thương phẩm.
Hoạt tính CMCase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân CMC trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.
Hoạt tính xylanase được tính bằng số µmol D-xylose tạo ra khi thủy phân xylan trong một phút bởi một ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.