CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.6.2. Phương pháp điện di Zymogram
Nguyên tắc: Hỗn hợp gồm các enzyme và protein được phân tách trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất (CMC hoặc xylan). Sau khi phân tách, phản ứng enzyme được tiến hành trong gel, enzyme có mặt sẽ thuỷ phân cơ chất. Sau phản ứng, bản gel sẽ được nhuộm Congo Red. Những phần cơ chất bị enzyme thuỷ phân sẽ khơng bắt màu thuốc nhuộm, và do đó tạo nên các băng màu sáng hơn so với màu nền của gel.
Thành phần gel: Giống với thành phần gel SDS-PAGE chỉ khác ở phần running gel thay nước cất bằng dung dịch cơ chất.
- Ngâm gel trong 100 ml 2% Triton X-100, lắc 30 phút (làm 2 lần).
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) lạnh, lắc 15 phút (làm 2 lần).
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) ấm 30 phút ở 50°C (hoặc lâu hơn đến 12 giờ).
- Nhuộm gel trong 100 ml dung dịch Congo red 0.1%, lắc 30 phút.
- Cố định màu bằng cách rửa gel trong 200 ml NaCl 1M, rửa 2 lần mỗi lần 15 phút.
- Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả. 2.4.7. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc
Tế bào nấm mốc được nuôi lắc trong môi trường YM dịch ở 50°C trong 2-3 ngày. Lấy 2 vịng que cấy tế bào cho vào Eppendorf vơ trùng và thêm 750 µl SSC 2 vào mỗi ống. Lắc đều và đun ở 100°C trong 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 l nước cất vô trùng, 100 l hạt thủy tinh, 150 l dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN, sau đó ADN được giữ ở -20°C.
2.4.8. Phương pháp tinh chế ADN
Do ADN của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng ADN làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế ADN bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit. Hút 50 l dịch trong chứa ADN cho vào Eppendorf vô trùng. Bổ sung 150 l dung dịch Binding buffer có chứa Silica. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 2 phút. Hút bỏ dịch do ADN đã bám trên bề mặt các hạt thủy tinh. Rửa 3 lần bằng Washing buffer. Sau đó phơi khơ rồi bổ sung 15 l nước cất vô trùng dùng cho PCR. Ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút, ADN ở phần dịch nổi là
ADN đã được tinh chế. ADN sau khi tinh chế có thể dùng làm khn cho phản ứng PCR, phần còn lại giữ ở -20C.
2.4.9. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing
Phản ứng PCR fingerprinting được tiến hành với thành phần phản ứng: Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR fingerprinting. Thành phần Thể tích Đệm phản ứng (10x) 10 l MgCl2 (25 mM) 4 µl dNTPs (20 mM mỗi loại) 2 l Mồi MST2 (GAC)5 (20 M) 4 l
Taq DNA polymerase (5 u/l) 0,5 l
ADN khuôn 1,5 l
Nước dùng cho PCR 78 l
Tổng cộng 100 l
Tùy vào các mục đích khác nhau thể tích thành phần phản ứng có thể thay đổi khi đó thể tích của các thành phần được điều chỉnh sao cho tỉ lệ giữa chúng không thay đổi. Sau khi trộn các thành phần phản ứng như trên, phản ứng được tiến hành trên máy PE-GeneAmp PCR system 9700 với chu trình nhiệt như sau: Biến tính 94°C trong vịng 2 phút. Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94°C trong vịng 40 giây, gắn mồi ở 52°C trong 1 phút 30 giây và kéo dài ở 72°C trong 2 phút.
2.4.10. Phương pháp điện di ADN
Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1.5% với dung dịch đệm là 0.5TAE. Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1.5% được đun tan trong đệm TAE bằng lị vi sóng. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60-70°C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược. Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE. Dùng micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản
gel. Với các gel sử dụng răng lược nhỏ, dùng 3-5 l mẫu cho mỗi giếng. Điện di với hiệu điện thế 50V.
2.4.11. Nhuộm gel và đọc kết quả
Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0.5 g/ml pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước cất để loại bỏ ethidium bromide bám không đặc hiệu. Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát bằng máy soi gel Benchtop UV-Transilluminator VWR. Ảnh được chụp bằng máy ảnh Olympus 4040Z.
2.4.12. Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA
ADN sau khi được tách và tinh chế như trên, tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS của rDNA với thành phần và tỷ lệ như sau:
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS.
Thành phần Thể tích Đệm phản ứng (10x) 10 l MgCl2 (25 mM) 4 µl dNTPs (20mM mỗi loại) 4 l Mồi ITS1 (10 M) 2 l Mồi NL4 (10 M) 2 l
Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l
DNA khuôn 1 l
Nước dùng cho PCR 76,5 l
Tổng cộng 100 l
Tiến hành nhân đoạn ADN bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System 9700 (PE). Chu trình gia nhiệt như sau: Biến tính 94°C trong vịng 2 phút. Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94°C trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52°C trong 1 phút và kéo dài ở 72°C trong 2 phút.
Sản phẩm PCR sau đó cũng được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng ethidium bromit như trên, và soi bằng máy soi gel. Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit. Sau đó sản phẩm PCR được đọc
trình tự với mồi ITS4 và NL1. Kết quả đọc trình tự được xử lý với phần mềm BioEdit.
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệt 3.1.1. Kết quả phân lập 3.1.1. Kết quả phân lập
Nấm mốc chịu nhiệt thường có mặt trong các loại đất và bên trong sự phân hủy các chất hữu cơ được tích lũy trong mơi trường ấm áp, ẩm ướt, và hiếu khí. Ví dụ quen thuộc nhất là đống phân ủ vườn, đặc biệt hơn là phân ủ của các nhà máy xử lý chất thải, và các compost được sử dụng để sản xuất nấm thương mại. Hệ vi sinh vật trong phân compost có khả năng thủy phân mạnh cellulose cũng như các hợp phần khác của lignocellulose. Nhiệt độ trung bình trong đống ủ khoảng 40°C-50°C và có thể lên tới 80°C-90°C vì vậy hệ vi sinh vật trong đống ủ chủ yếu là các chủng chịu nhiệt đặc biệt là nấm mốc và vi khuẩn đặc biệt là nhóm nấm mốc chịu nhiệt.Với mục đích tìm kiếm các enzyme thủy phân lignocellulose mạnh chúng tôi tiến hành phân lập các chủng nấm mốc chịu nhiệt trong các mẫu phân compost và đất thu thập từ các địa điểm khác nhau trên địa bản Hà Nội và một số tỉnh thành.
Các loại mẫu khác nhau được thu thập ở các địa điểm khác nhau trên địa bàn Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Yên Bái. Môi trường dùng cho phân lập có thành phần như đã nêu ở phần 2.3.1. Từ 20 mẫu khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.1.
Kết quả phân lập cho thấy các chủng nấm mốc chịu nhiệt được tìm thấy trong các mẫu chứa nguyên liệu hữu cơ được ủ lớn hơn và đa dạng hơn rất nhiều so với các mẫu đất và lá cây thông thường đặc biệt là các compost do bà con nông dân ủ đống rơm rạ, rác thải… với phân trâu bò, lợn gà và các mẫu compost xưởng trồng nấm là đa dạng hơn cả. Điều này cũng dễ hiểu do nguồn chất dinh dưỡng trong các mẫu này quá phong phú tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều nhóm vi sinh vật phát triển. Các chủng nấm mốc sau khi phân lập sẽ được phân nhóm bằng hình thái tế bào, phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting.
Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc phân lập được.
STT Tên mẫu Nơi lấy mẫu Ký hiệu chủng
1 Phân ủ Lý Nhân, Hà Nam FCH 5.1, FCH 5.2, FCH 5.3, FCH 5.4, FCH 5.5, FCH 5.6, FCH 5.7, FCH 6.1, FCH 6.2, FCH 6.3, FCH 6.4, FCH 6.5 Yên Bái FCH 12.1, FCH 14.1, FCH 14.3 Đông Anh- Hà Nội FCH 116.3
Nhội- Đông Anh- Hà Nội FCH 130.2
2 Nguyên liệu ủ xưởng trồng nấm
Yên Nghĩa, Hà Đông
FCH 7.1, FCH 7.2, FCH 8.1, FCH 8.2, FCH 9.1, FCH 9.2, FCH 9.3,
FCH 9.4 Tầm xá-Đông Anh- Hà Nội FCH 133.2, FCH 112.2 Nam Hồng-Đông Anh- Hà Nội FCH 143.4 3 Phân ủ nhà máy xử
lý rác Cầu Diễn Từ Liêm, Hà Nội
FCH 10.1, FCH 10.4, FCH 10.5, FCH 10.6
4 Đất và lá cây Ba vì, Hà Tây FCH 20.1, FCH 23.1, FCH 26.1, FCH 30.1, FCH 31.1, FCH 32.1 5 Rơm dạ mục Xuân Nộn-Đông Anh-
Hà Nội
FCH 102.1, FCH 121.3, FCH 121.4, FCH 136.2
6 Bịch nấm linh chi Công ty XNK nông sản ĐNA FCH 156.3 7 Mùn cưa ủ mục Lỗ khê-Đông Anh-Hà Nội FCH 142.4 8 Bã tinh bột sắn ủ Hoài Đức, Hà Nội FCH 149.2, FCH 151.3
3.1.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào
Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường PDA thạch đĩa ở 50°C để quan sát hình thái khuẩn lạc và chụp ảnh tế bào. Sau 2-3 ngày nuôi cấy trên mơi trường PDA, hình dạng và màu sắc của các chủng nấm mốc phân hóa khá rõ ràng. Hình thái tế bào và bào tử của các chủng được quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học Eclipse E600-Nikon ở vật kính 40 và được chụp thơng qua camera JVC bằng phần mềm video capture. Quan sát hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc chúng tơi nhận thấy có sự phân hóa khá đa dạng. Khuẩn lạc ban đầu ở dạng sợi trắng sau 2-3 ngày nuôi cấy bắt đầu chuyển sang màu nâu, xám, xanh đen hoặc đen…Khuẩn lạc có nhiều dạng như nhung mịn, bơng xốp…
Hình 3.1. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.1
Hình 3.2. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.3
Hình 3.4. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 10.4
Hình 3.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 112.2
Hình 3.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 23.1
Hầu hết các chủng nấm mốc phân lâp được đều có bào tử. Bào tử nấm mốc quen thuộc chỉ có ở một số chủng như FCH 5.1 cuống bào tử dạng bình khơng phân nhánh, bảo tử đính khơng có túi bao bao bọc hoặc có túi bao bọc như các chủng FCH 5.2. Một số chủng nấm mốc có bào tử như FCH 5.1, FCH 5.5 có mặt ở rất
lạc và tế bào giống nhau được nhóm chung vào một nhóm và tiếp tục được phân nhóm chính xác hơn nhờ kĩ thuật PCR-fingerprinting.
3.1.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting
Để đánh giá tính đa dạng của các chủng nấm mốc phân lập được một cách chính xác, chúng tơi tiến hành phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 46 chủng phân lập được sử dụng mồi MST2 (có trình tự 5’-(GAC)5-3’). Chủng giống được nuôi cấy trên môi trường YM lỏng, lắc 150 rpm/ phút trong 2-3 ngày, sau đó tiến hành tách và tinh chế ADN. ADN sau khi tinh chế được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR. Sản phẩm được điện di trên agarose 1% trong TAE với hiệu điện thế 50V. Kết quả thể hiện ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Phổ fingerprinting của 46 chủng nấm mốc phân lập được Bảng 3.2. Ký hiệu các chủng trong phổ fingrprinting
Kí hiệu Chủng Kí hiệu Chủng Kí hiệu Chủng Kí hiệu Chủng 1 FCH 5.1 13 FCH 5.7 25 FCH 133.2 37 FCH 102.1 2 FCH 6.1 14 FCH 6.4 26 FCH 130.2 38 FCH 136.2 3 FCH 9.1 15 FCH 5.4 27 FCH 14.1 39 FCH 149.2 4 FCH 10.1 16 FCH 151.3 28 FCH 151.3 40 FCH 121.3 5 FCH 5.3 17 FCH 7.1 29 FCH 23.1 41 FCH 12.1 6 FCH 6.2 18 FCH 7.2 30 FCH 30.1 42 FCH 20.1
7 FCH 5.5 19 FCH 8.2 31 FCH 142.4 43 FCH 31.1 8 FCH 6.5 20 FCH 9.2 32 FCH 112.2 44 FCH 116.3 9 FCH 8.1 21 FCH 9.3 33 FCH 14.3 45 FCH 143.4 10 FCH 10.6 22 FCH 9.4 34 FCH 156.3 46 FCH 26.1 11 FCH 5.2 23 FCH 10.4 35 FCH 121.4 12 FCH 6.3 24 FCH 10.5 36 FCH 32.1
Từ kết quả thể hiện ở phổ fingerprinting cho thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MTS2 của các chủng nấm mốc có các phổ băng khác nhau và khá đa dạng do sự phân bố về số lượng bản sao cũng như vị trí của ADN vệ tinh trong genome. Kỹ thuật phân nhóm sử dụng mồi thiết kế dựa trên ADN vệ tinh cho độ phân giải đến dưới loài. Các chủng có cùng một phổ băng chắc chắn sẽ thuộc cùng một lồi, các chủng có phổ băng khác nhau có thể sẽ thuộc các lồi khác nhau tùy theo mức độ khác biệt. Các chủng có cùng phổ băng sau đó được xếp cùng một nhóm.
3.1.4. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tôi chọn ra chủng đại Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tơi chọn ra chủng đại diện để phân tích trình tự. Chúng tơi chọn vùng ITS của rDNA để phân tích. Đoạn gen này có kích thước khoảng 600 bp và thường được dùng trong phân loại định tên nấm mốc. Chúng tôi đã tách ADN tổng số của các chủng nấm mốc sau đó dùng PCR nhân đặc hiệu đoạn ADN (kích thước khoảng 1200bp) chứa vùng ITS bằng cặp mồi ITS1, ITS4. Sản phẩm PCR được tinh chế và đọc trình tự. Kết quả đọc trình tự sau đó được xử lý bằng phần mềm BioEdit và so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank sử dụng BLAST. Tên loài cho các chủng được gán dựa trên sự tương đồng với trình tự gần nhất đăng ký trên GenBank.
Bảng 3.3. Tên phân loại của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
STT Kí hiệu chủng Tên phân loại Căn cứ xác định tên loài 1 FCH 5.1 Aspergillus fumigatus rDNA sequencing ITS
2 FCH 6.1 Aspergillus fumigatus Finger MST2
3 FCH 9.1 Aspergillus fumigatus Finger MST2
4 FCH 10.1 Aspergillus fumigatus Finger MST2
5 FCH 5.2 Rhizomucor miehei rDNA sequencing ITS
6 FCH 6.3 Rhizomucor miehei Finger MST2
STT Kí hiệu chủng Tên phân loại Căn cứ xác định tên loài
9 FCH 6.4 Rhizomucor pusillus Finger MST2
10 FCH 20.1 Rhizomucor pusillus rDNA sequencing ITS
11 FCH 26.1 Rhizopus microsporus rDNA sequencing ITS
12 FCH 5.3 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
13 FCH 6.2 Scytalidium thermophilum Finger MST2
14 FCH 121.3 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
15 FCH 121.4 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
16 FCH 14.3 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
17 FCH 5.5 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
18 FCH 6.5 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
19 FCH 8.1 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
20 FCH 10.6 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
21 FCH 12.1 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
22 FCH 30.1 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
23 FCH 31.1 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
24 FCH 32.1 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
25 FCH 130.2 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
26 FCH 143.4 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
27 FCH 149.2 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
28 FCH 7.1 Chaetomium thermophilum rDNA sequencing ITS
29 FCH 7.2 Chaetomium thermophilum Finger MST2
30 FCH 8.2 Chaetomium thermophilum Finger MST2
31 FCH 23.1 Myceliophthora thermophila rDNA sequencing ITS
32 FCH 5.4 Myceliophthora fergusii rDNA sequencing ITS
33 FCH 102.1 Myceliophthora thermophila Finger MST2
34 FCH 112.2 Myceliophthora thermophila rDNA sequencing ITS
35 FCH 133.2 Myceliophthora thermophila Finger MST2
36 FCH 156.3 Myceliophthora thermophila Finger MST2
37 FCH 9.2 Thielavia terrestris rDNA sequencing ITS
38 FCH 9.3 Thielavia terrestris rDNA sequencing ITS
39 FCH 9.4 Thielavia terrestris rDNA sequencing ITS
40 FCH 136.2 41 FCH 142.4 42 FCH 151.3 43 FCH 14.1
44 FCH 10.5 Malbranchea cinnamomea rDNA sequencing ITS
45 FCH 5.6 Melanocarpus albomyces rDNA sequencing ITS