CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.3. Các kỹ thuật xét nghiệm định danh và xác định nồng độ ức chế tối thiểu của
1.3.2. Các kỹ thuật kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu
Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được thực hiện bằng một số phương pháp như sau: Pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng (macrodilution và microdilution), pha loãng kháng sinh trong thạch, khuếch tán kháng sinh từ E-test… Bên cạnh đó, cịn có thể xác định bằng các hệ thống máy tự động như VITEK2-compact, Phoenic,…
Nguyên tắc chung của xác định MIC là cho vi khuẩn thử nghiệm tiếp xúc với các nồng độ kháng sinh giảm dần trong môi trường dinh dưỡng rồi xác định nồng độ thấp nhất của kháng sinh mà tại đó vi khuẩn bị ức chế hồn tồn.
Kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng E-test
E-test là que giấy bằng nitrocellulose, trên đó có tẩm kháng sinh thành một dãy có hàm lượng giảm dần. Khi đặt que E-test lên mặt môi trường đã trải vi khuẩn, kháng sinh từ E-test sẽ khuếch tán ra môi trường cũng theo nồng độ giảm dần, nhờ vậy mà sự phát triển của vi khuẩn xung quanh E-test sẽ bị ức chế hình thành một vùng vơ khuẩn có hình elip. Điểm cắt của vùng vô khuẩn khi tiếp giáp với E-test cho biết giá trị MIC của kháng sinh và được đọc bằng giá trị ghi trên điểm giao cắt này.
Hình 1.9. Quy trình thực hiện kháng sinh đồ xác định MIC bằng phương pháp sử dụng E-test [67]
Quy trình thực hiện kháng sinh đồ bằng E-test cụ thể như sau: + Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm
+ Môi trường làm kháng sinh đồ bằng phương pháp E-test + Kỹ thuật dàn vi khuẩn lên môi trường
+ Đặt E-test lên mặt môi trường kháng sinh đồ đã trải vi khuẩn
Thanh E-test được giữ trong các hộp hoặc các túi kín có chất hút ẩm và được lấy khỏi tủ lạnh khoảng 1 giờ trước khi thực hiện kỹ thuật để đảm bảo nhiệt độ thanh E-test bằng với nhiệt độ phịng, khi đó sẽ tránh được hiện tượng nước ngưng tụ trên thanh E-test và làm giảm hàm lượng kháng sinh trong thanh. Dùng kẹp vô trùng gắp và đặt thanh E-test trên bề mặt môi trường thử nghiệm. Khi đặt, cần để mặt số ở trên và ấn thật nhẹ để đảm bảo E-test tiếp xúc đều với mặt thạch. Que E- test đặt xong khơng được di chuyển vị trí. Với đĩa thạch đường kính 90mm thì có thể đặt tối đa 2 thanh ngược chiều nhau.
+ Nuôi ủ và đọc kết quả
Sau khi đã đặt que E-test lên mặt môi trường, đặt môi trường nuôi ủ trong nhiệt độ 350C trong tủ ấm, khí trường thích hợp.
Hình 1.10. E-test và xác định MIC bằng E-test (MP: Ký hiệu của kháng meropenem, vùng vô khuẩn cắt E-test tại giá trị 0,125 nên MIC của meropenem meropenem, vùng vô khuẩn cắt E-test tại giá trị 0,125 nên MIC của meropenem
đối với vi khuẩn 0,125µg/ml). Nguồn: NK-BIOTEK [67]
Kỹ thuật kháng sinh đồ bằng máy VITEK2-compact
Xác định mức độ kháng kháng sinh bằng máy tự động VITEK 2 – compact dựa trên nguyên lý: hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng; Dùng phương pháp đo độ đục của vi khuẩn bằng việc sử dụng card kháng sinh đồ để xác định MIC - nồng độ ức chế tối thiểu, bằng máy VITEK 2 – compact.
Xác định MIC bằng phƣơng pháp pha loãng kháng sinh trong thạch
Đây là một trong những phương pháp cổ điển nhất trong xác định nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn với kháng sinh. Các kháng sinh sẽ được pha loãng ở các nồng độ pha loãng bậc hai khác nhau trong từng đĩa petri. Ưu điểm của phương pháp này là khả năng thử nghiệm đồng thời nhiều chủng với một nồng độ kháng sinh nhất định trong một lần thử nghiệm, kỹ thuật này cũng có thể áp dụng đối với các vi khuẩn khó phát triển trong mơi trường canh thang (ví dụ: Vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn N. gonorrhoeae). Nhược điểm của kỹ thuật này là tốn thời gian.
Kháng sinh đồ xác định MIC của bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch được áp dụng để có thể thực hiện kháng sinh đồ hồng loạt chủng cho một hay nhiều kháng sinh. Phương pháp này hiếm khi được thực hiện để trả lời kết quả cho lâm sàng mà thường chỉ được tiến hành trong nghiên cứu phục vụ mục tiêu giám sát nhiễm khuẩn, điều tra dịch tễ hay các nghiên cứu theo dõi đề kháng và khuynh hướng đề kháng của các vi khuẩn phân lập từ lâm sàng có khuynh hướng đề kháng nổi trội.
Môi trường làm kháng sinh đồ tốt nhất là MHA (Mueller-Hinton Agar). Kháng sinh được pha theo nồng độ giảm dần trên mỗi đĩa MHA. Trên cùng một đĩa kháng sinh có thể thực hiện thử nghiệm đồng thời nhiều chủng.
Pha loãng kháng sinh trong ống nghiệm và trong giếng (broth microdilution và broth microdilution)
Đây cũng là một trong những phương pháp cổ điển nhất nhằm xác định MIC của vi khuẩn. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý vi khuẩn được phát triển trong môi trường canh thang với nồng độ kháng sinh giảm dần theo nồng độ pha loãng bậc hai. Hai kỹ thuật này chỉ khác nhau ở cách thức tiến hành và thể tích mơi trường ni cấy (macrodilution có thể tích mơi trường ni cấy tối thiểu 2-5ml, trong khi đó microdilution có thể tích mơi trường nuôi cấy tối đa là 100µl). Chi tiết về kỹ thuật sẽ được đề cập đến trong phần Phương pháp nghiên cứu.
Hình 1.12. Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật microdilution (pha loãng trong giếng) [67] (pha lỗng trong giếng) [67]
Hình 1.13. Quy trình xác định MIC bằng kỹ thuật macrodilution (pha loãng trong ống nghiệm) [67] (pha loãng trong ống nghiệm) [67]
EUCAST và CLSI khuyến cáo, nên dùng kỹ thuật microdilution để thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn với colistin. Tuy nhiên, trên thực tế, rất ít các phòng xét nghiệm vi sinh sử dụng kỹ thuật này trong quy trình xét nghiệm thường quy. Nghiên cứu của Matuschek E và cộng sự tiến hành năm 2017 trên 75 chủng vi
khuẩn Gram âm, kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng kỹ thuật E-test với kỹ thuật microdilution được sử dụng làm tham chiếu, cho kết quả EA là 43%. Theo kết quả của nghiên cứu, tác giả khuyến cáo không nên sử dụng E-test trong việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu của colistin [43]. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Janet A Hindler và cộng sự năm 2013, tiến hành trên 107 chủng vi khuẩn Gram âm đa kháng, EA là 47% [31].
Phương pháp khoanh giấy khuếch tán không đáng tin cậy để xác định tính nhạy cảm với colistin [21, 55].
Ở K. pneumoniae, CA giữa E-test và BDM là 77%, VME là 31% và 28%,
tương ứng với colistin và polymyxin B. Một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra CA là 56%, VEM là 41,5% và ME là 2,4% giữa BMD và E-test. Mặc dù, hệ thống VITEK 2 cho tỷ lệ CA cao (93-97%), tuy nhiên, VME lại cao (3-11%). Nghiên cứu này đã đưa ra kết luận, hệ thống VITEK 2 và E-test đều cho hiệu suất kém khi xác định MIC colistin của vi khuẩn. Cần tiến hành kỹ thuật BMD [65]. Chew KL và cộng sự đã nghiên cứu trên 76 chủng đường ruột. (EA) của kết quả xét nghiệm colistin giữa BMD và VITEK 2, Sensititre, và E-test lần lượt là 93,4%, 89,5% và 75,0%. Tỷ lệ kết quả xét nghiệm EA của polymyxin B giữa BMD và VITEK 2, Sensititre và E- test lần lượt là 96,1%, 96,1% và 48,7%. Mặc dù tương quan MIC dương tính (Spearman's ρ = 0,873) với phương pháp tham chiếu đã đạt được cho thử nghiệm colistin với VITEK 2, EA <90%, với tỷ lệ lỗi rất lớn là 36%. Tương quan với E-test MIC thấp hơn, với tỷ lệ lỗi rất lớn là 12% (colistin) và 26,1% (polymyxin B). Thỏa thuận phân loại của MicroScan (colistin) là 88,2%, với tỷ lệ lỗi rất lớn là 4%. Như vậy, đối với các kỹ thuật sử dụng hệ thống VITEK 2 và E-test, đều đặt ra vấn đề về tính chính xác của kết quả thử nghiệm [12, 37].
Nghiên cứu của T.Y. Tan và cộng sự được đăng tải trên Pubmed đã chỉ ra rằng, hệ thống VITEK 2 khơng đáng tin cậy để phát hiện tính kháng colistin [61].
Balaji Veeraraghavan đã nêu ra kỹ thuật khoanh giấy đối với kháng sinh polymyxin là khơng khả thi vì trọng lượng phân tử của chúng lớn dẫn đến sai sót rất
lớn trong kết quả. CLSI khuyến cáo sử dụng kỹ thuật vi pha lỗng. CLSI cũng khơng chấp nhận việc sử dụng P-80 trong kỹ thuật xác định MIC của vi khuẩn do khả năng gây ra tác dụng diệt khuẩn hiệp đồng của P-80 và polymyxin. Bên cạnh đó, P-80 cũng là một chất hoạt động bề mặt và có tính kháng khuẩn nhẹ, như vậy khi sử dụng P-80 trong kỹ thuật vi pha lỗng có thể làm ảnh hưởng đến giá trị MIC colistin đối với vi khuẩn [10].
Shelby Simar và cộng sự đã tiến hành so sánh kỹ thuật E-test với kỹ thuật vi pha loãng để xác định MIC polymyxin B và polymyxin E. Kết quả, EA giữa E-test polymyxin E và polymyxin B với kỹ thuật vi pha loãng lần lượt là 59% và 61%, CA tương ứng là 89% và 88% [60].
Nghiên cứu của Shamina OV và cộng sự, tiến hành trên 119 chủng K.
pneumoniae kháng carbapenem phân lập từ các bệnh nhân đến từ 3 bệnh viện ở
Moscow trong những năm 2012 – 2016, so sánh tỷ lệ kháng colistin của vi khuẩn sử dụng phương pháp E-test và VITEK 2 Compact, sử dụng phương pháp microdilution làm phương pháp tham chiếu. Kết quả cho thấy CA, EA của cả hai phương pháp này so với microdilution đều nhỏ hơn 90% trong khi đó VME lần lượt là 26% và 34%. Kết quả của nghiên cứu này đưa ra lời cảnh báo với các bệnh viện nên thận trọng trong việc sử dụng E-test và VITEK 2 trong xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh colistin [59].
Như vậy, ta thấy, đã có rất nhiều nghiên cứu của nước ngoài chỉ ra rằng kỹ thuật E-test (mà hiện tại đang áp dụng trên lâm sàng tại Việt Nam) khơng thích hợp để xác định MIC của colistin đối với vi khuẩn Gram âm. EUCAST và CLSI khuyến cáo, chỉ có duy nhất kỹ thuật microdilution được sử dụng để làm tham chiếu trong xác định MIC của colistin với vi khuẩn, tuy nhiên kỹ thuật này lại yêu cầu khá tỉ mỉ, vì vậy việc tìm ra một phương pháp chính xác và phù hợp để áp dụng trong lâm sàng là vô cùng cần thiết. Các nghiên cứu nói trên cũng đã chỉ ra sự tương đồng trong hiệu quả của phương pháp macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Gram âm đa kháng với kháng sinh colistin [13, 42, 32, 22] và sự không
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này được công bố ở Việt Nam. Phương pháp macrodilution và microdilution cũng chưa được đưa vào sử dụng ở các phòng xét nghiệm trong nước. Do vậy, nghiên cứu về sự phù hợp giữa phương pháp macrodilution và phương pháp microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh colistin là vơ cùng cần thiết. Khi có được kết quả nghiên cứu này, chúng ta sẽ có cơ sở để khuyến cáo triển khai trên lâm sàng trong xác định nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn với colistin, hạn chế tối đa các sai sót trong kết quả MIC đối với colistin. Chính vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá hiệu
quả của kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với colistin của một số chủng vi khuẩn Gram âm” này với mục tiêu:
So sánh kỹ thuật macrodilution và microdilution trong xác định mức độ nhạy cảm với colistin của một số chủng vi khuẩn Gram âm.