CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.3. Các kỹ thuật nghiên cứu
2.4.3.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy phân lập
Công thức pha môi trường thạch máu theo hướng dẫn của nhà sản xuất: + Blood agar base: 40g
+ Nước cất 2 lần: 1000ml
+ Máu thỏ: 50ml (5%)
Cân chính xác 40g bột Blood agar base, cho vào 1000 ml nước RO, đun nóng cho đến khi mơi trường tan hồn tồn.
Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút
Để nguội môi trường về nhiệt độ khoảng 45-50o
C, cho 50ml máu vào quay trịn bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn.
Sau khi thạch đã được đóng gói, lấy 5% số mơi trường vừa sản xuất cho vào tủ ấm 37o
C để qua đêm để kiểm tra tính vơ trùng của mơi trường;
Kiểm tra chất lượng đĩa môi trường thạch máu:
Kiểm tra môi trường để qua đêm trong tủ ấm 37oC
Kết quả: Đạt khi vi khuẩn không mọc, không đạt khi vi khuẩn mọc. Bảo quản thạch ở nhiệt độ 2-8oC trong tủ lạnh
+ Ghi chép vào sổ pha môi trường và sổ kiểm tra chất lượng môi trường. Công thức pha môi trường thạch thường theo hướng dẫn của nhà sản xuất: Nutrient agar: 28g
Nước RO: 1000ml
Cân chính xác 28g bột nutrient agar, cho vào 1000 ml nước RO, đun nóng cho đến khi mơi trường tan hồn tồn.
Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút;
Để nguội môi trường về nhiệt độ khoảng 45-50oC, đổ 20ml/đĩa.
Sau khi thạch đã được đóng gói, lấy 5% số mơi trường vừa sản xuất cho vào tủ
ấm 37oC để qua đêm để kiểm tra tính vơ trùng của mơi trường;
+ Kiểm tra chất lượng đĩa môi trường thạch thường:
Kiểm tra môi trường để qua đêm trong tủ ấm 37oC
Kết quả: Đạt khi vi khuẩn không mọc, không đạt khi vi khuẩn mọc. Bảo quản thạch ở nhiệt độ 2-8oC trong tủ lạnh
+ Ghi chép vào sổ pha môi trường và sổ kiểm tra chất lượng môi trường. Công thức pha môi trường Cation – Adjusted Mueller Hinton theo hướng dẫn của nhà sản xuất :
Cation – Adjusted Mueller Hinton: 21g Nước RO: 1000ml
Cân chính xác 21g bột Blood agar base, cho vào 1000 ml nước RO, đun nóng cho đến khi mơi trường tan hồn tồn.
Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút;
+ Đo pH của dung dịch CAMB: đổ 5 – 10ml canh thang CAMB vào ống falcon 50ml để đo pH. pH có giá trị 7,2 – 7,4 là đạt yêu cầu. Nếu dung dịch có pH<7 cần bổ sung thêm NaOH 1M; nếu pH >7,5, cần thêm HCl 1M lắc đều rồi đo lại.
+ Chia dung dịch CAMB vào các ống falcon 50ml, ghi tên môi trường và ngày sản xuất. Bảo quản môi trường trong ngăn mát tủ lạnh.
Để nguội đến khoảng 45 - 500C, chắt ra các ống để lưu trữ.
Lấy 5% số môi trường vừa sản xuất cho vào tủ ấm 37oC để qua đêm để kiểm
tra tính vơ trùng của mơi trường;
+ Kiểm tra chất lượng môi trường CAMHB bằng cách như sau: Lấy 3 ống môi trường ngẫu nhiên (1 ống lúc bắt đầu đổ, một ống giữa quá trình đổ và một ống cuối quá trình đổ), cấy vào thạch máu, để qua đêm trong tủ ấm 370C
Kết quả: Đạt khi vi khuẩn không mọc, không đạt khi vi khuẩn mọc.
Bảo quản môi trường ở nhiệt độ 2-8oC trong tủ lạnh
+ Ghi chép vào sổ pha môi trường và sổ kiểm tra chất lượng môi trường.
2.4.3.2. Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn trong thử nghiệm
+ Đặt môi trường thạch máu vào tủ ấm 37oC trước khi sử dụng 30 phút
+ Ghi mã nghiên cứu của vi khuẩn thử nghiệm.
+ Cấy phân vùng các vi khuẩn thử nghiệm trên thạch máu. + Các đĩa nuôi cấy được để tủ ấm 37°C.
+ Định danh lại các loại khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy bằng máy MALDI Biotyper.
+ Cấy chuyển
+ Dùng thạch thường, ghi mã số nghiên cứu, loại bệnh phẩm, tên vi khuẩn, loại môi trường nuôi cấy, ngày lấy mẫu
+ Để tủ ấm 37°C từ 18 – 24 giờ
2.4.3.3. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng máy MALDI Biotyper
Định danh vi khuẩn bằng máy MALDI Biotyper để khẳng lại đúng các chủng
vi khuẩn thử nghiệm
Chuẩn bị hoá chất:
Pha “Stock Solution” – Dung môi dùng cho HCCA Matrix và Bruker Test
Standard (BTS).
+ Lấy 1 ống Eppendorf và cho vào đó 475 μL nước siêu tinh khiết, 500 μL Acetonitrile (ACN) 100% và 25 μL Trifluoracetic acid 100% (TFA).
+ Trộn đều bằng vortex. Như vậy ta có được 1 mL hỗn hợp, gọi là “stock solution”. Stock solution có thể bảo quản ở nhiệt độ phịng.
Pha HCCA Matrix: hóa chất định danh
+ Lấy 1 ống HCCA Matrix, cho vào đó 250 μL stock solution.
+ Vortex ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dung dịch trong suốt (tất cả tinh thể HCCA đều được hòa tan, nồng độ cuối là 10 mg HCCA/mL).
+ Dung dịch HCCA Matrix đã sẵn sàng để sử dụng
Dung dịch HCCA Matrix đã chuẩn bị được bảo quản ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng trực tiếp. Sử dụng trong vòng 2 tuần kể từ ngày chuẩn bị.
Hình 2.1: Hóa chất định danh MALDI-TOF
Pha Bruker Test Standard (BTS): hóa chất chuẩn
+ Lấy 1 ống BTS, cho vào đó 50 μL dung dịch gốc chuẩn. Dùng pipet trộn ít nhất 20 lần ở nhiệt độ phòng, tránh tạo bọt.
+ Để ở nhiệt độ phịng 5 phút, sau đó lại trộn lại ít nhất 20 lần, tránh tạo bọt. + Nếu dung dịch vẫn còn đục, thực hiện quay ly tâm 2 phút với tốc độ 13000 rpm ở nhiệt độ phòng.
+ Dung dịch BTS đã sẵn sàng để sử dụng. Nên chia nhỏ ra làm nhiều ống
(chẳng hạn chia làm 10 ống, mỗi ống 5 μL) và bảo quản ở nhiệt độ dưới -18oC. Nếu
thao tác chuẩn bị tốt, dung dịch BTS có thể bền trong 5 tháng ở điều kiện bảo quản đã nêu ở trên.
Hình 2.2: Hóa chất chuẩn - BTS
Định danh bằng hệ thống máy MALDI-TOF
Quy trình thực hiện:
Mẫu là khuẩn lạc tươi, đối với những loài vi sinh vật chậm phát triển có thể sử
dụng mẫu cấy sau vài ngày. Không nên bảo quản các đĩa chứa khuẩn lạc dưới 4oC
bởi vì điều này dẫn đến sự suy giảm chất lượng phổ rất nhanh chóng. Tuy nhiên, có thể bảo quản các đĩa khuẩn lạc ở nhiệt độ phòng trong vài ngày.
Quy trình chuẩn bị mẫu cho chạy MALDI TOF như sau: - Ghi sơ đồ mẫu;
+ Nhỏ 1 μL dung dịch BTS vào một vị trí của đĩa MALDI TOF; + Phết mỗi mẫu khuẩn lạc thuần lên một vị trí của đĩa MALDI TOF;
+ Lưu ý chỉ phết một lượng nhỏ khuẩn lạc (vừa đủ nhìn thấy), có thể sử dụng tăm tiệt trùng để phết;
+ Để mẫu khô ở nhiệt độ phòng;
+ Cho 1 μL dung dịch HCCA Matrix lên mỗi vị trí mẫu; + Để khơ ở nhiệt độ phòng (5 – 20 phút);
+ Đưa đĩa MALDI TOF vào máy MALDI Biotyper để thực hiện định danh; + Khởi động hệ thống:
Nhận định kết quả:
Giá trị Phiên giải
2.000 - 3.000 Độ tin cậy cao
1.700 - 1.999 Độ tin cậy trung bình
0.000 - 1.699 Khơng tin cậy
+ Kết quả mức xanh lá cây ứng với giá trị ≥2: Độ tin cậy cao, có thể chính xác đến cấp độ loài.
+ Kết quả mức vàng ứng với giá trị ≥1.7 và ≤1.999: Độ tin cậy trung bình, có kết quả chính xác cấp độ chi.
+ Kết quả mức đỏ ứng với giá trị < 1.7: Khơng có kết quả định danh hoặc kết quả khơng tin cậy.
Trả kết quả khi đạt được kết quả màu xanh lá cây, làm thêm một số xét nghiệm định danh khi kết quả màu vàng.
Khi đã định danh lại vi khuẩn thử nghiệm, ta tiến hành 2 kỹ thuật macrodilution và microdilution (theo hướng dẫn của CLSI) [53].
Kỹ thuật pha loãng kháng sinh macrodilution và microdilution là một trong những phương pháp cổ điển nhất nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của vi khuẩn đối với kháng sinh. Kỹ thuật dựa trên nguyên lý, vi khuẩn phát triển trong môi trường nuôi cấy được bổ sung kháng sinh theo các nồng độ pha loãng bâc hai. Giá trị MIC là nồng độ pha loãng kháng sinh mà ở đó vi khuẩn bị ức chế hồn toàn. Nguyên lý kỹ thuật macrodilution và microdilution là giống nhau, chỉ khác về thể tích canh thang ni cấy (macrodilution u cầu thể tích canh thang ni cấy từ tối thiểu từ 2-5mL, trong khi đó microdilution có thể tích canh thang ni cấy là dưới 100µl).
2.4.3.4. Quy trình xác định độ nhạy cảm colistin bằng kỹ thuật broth macrodilution [53]:
Chuẩn bị dải nồng độ kháng sinh:
+ Dải nồng độ kháng sinh colistin cần thử nghiệm là 16, 8; 4; 2; 1; 0,5; 0µg/mL.
+ Thể tích canh thang sử dụng cho mỗi nồng độ ít nhất là 1ml.
+ Mỗi khoanh giấy kháng sinh có hàm lượng 10µg colistin sulphate. Pha khoang giấy trong các thể tích canh thang khác nhau sẽ thu được nồng độ kháng sinh mong muốn. Sử dụng ống thủy tinh vô trùng dài 150mm, Ф 13 để pha kháng sinh như sau:
Nồng độ 0,25µg/mL: pha 40mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 0,5µg/mL: pha 20mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 1µg/mL: pha 10mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 2µg/mL: pha 5mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 4µg/mL: pha 2,5mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 8µg/mL: pha 1,25mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 16µg/mL: pha 0,625 mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 0µg/mL: pha 1mL canh thang + 0 khoanh giấy
+ Hoặc thay đổi số khoanh giấy trong cùng thể tích canh thang
Nồng độ 0,5µg/mL: pha 10mL canh thang + 1 khoanh giấy có hàm lượng kháng sinh 5µg colistin sulphate
Nồng độ 1µg/mL: pha 10mL canh thang + 1 khoanh giấy Nồng độ 2µg/mL: pha 10mL canh thang + 2 khoanh giấy Nồng độ 4µg/mL: pha 10mL canh thang + 4 khoanh giấy Nồng độ 8µg/mL: pha 10mL canh thang + 8 khoanh giấy
Nồng độ 16µg/mL: pha 10mL canh thang + 16 khoanh giấy Nồng độ 0µg/mL: pha 10mL canh thang + 0 khoanh giấy
+ Các ống kháng sinh sau khi chuẩn bị có thể sử dụng ngay hoặc để ngăn mát tử lạnh qua đêm và sử dụng trong vòng 1 – 2 ngày
+ Quá trình chuẩn bị ống kháng sinh tiến hành trong tủ cleanbench phịng mơi trường. Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn:
+ Phương pháp đo khuẩn lạc trực tiếp: Lấy 3 – 5 khuẩn lạc rời rạc được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng (thạch thường, thạch máu) trong thời gian 18 – 24h, hòa tan vào 1,5ml nước muối vô trùng 0,9%, vortex. Đo độ đục bằng máy
DensiCheck đạt 0,5McF (tương đương 108CFU/mL E.coli).
Cấy vi khuẩn và ủ
+ Trong vòng 15 phút sau khi đo độ đục, cần cấy vi khuẩn vào các ống kháng sinh. Các ống kháng sinh cần đưa ra nhiệt độ phòng 1 – 2 giờ trước khi cấy vi khuẩn. Các ống kháng sinh ghi nồng độ, tên chủng thử nghiệm và ngày trên thành ống.
+ Tiến hành thử nghiệm các chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm đồng
thời với chứng dương PC (Chủng P. aeruginosa MIC=16) và chủng chuẩn (P.
aeruginosa ATCC 27853) hoặc E. coli ATCC 25922 để kiểm tra kháng sinh. Đối với
mỗi mẻ thử nghiệm, sử dụng 1 ống nghiệm chứa 10ml canh tháng với 1 khoanh giấy, khơng có vi khuẩn để kiểm tra độ vơ trùng của dung dịch kháng sinh.
+ Nhỏ huyền dịch vi khuẩn với thể tích khác nhau với từng nồng độ kháng
sinh để đảm bảo mỗi ống nghiệm có 5x105CFU/mL
Nồng độ 0,25µg/mL: pha 40mL canh thang + 1 khoanh giấy + 200µl huyền dịch vi khuẩn
Nồng độ 0,5µg/mL: pha 20mL canh thang + 1 khoanh giấy + 100µl huyền dịch vi khuẩn
Nồng độ 2µg/mL: pha 5mL canh thang + 1 khoanh giấy+ 25µl huyền dịch vi khuẩn Nồng độ 4µg/mL: pha 2,5mL canh thang + 1 khoanh giấy+ 12,5µl huyền dịch vi khuẩn Nồng độ 8µg/mL: pha 1,25mL canh thang + 1 khoanh giấy+ 6,25µl huyền dịch vi khuẩn Nồng độ 16µg/mL: pha 0,625mL canh thang + 1 khoanh giấy + 3,125µl huyền dịch vi khuẩn
Nồng độ 0µg/mL: pha 1mL canh thang + 0 khoanh giấy+ 5µl huyền dịch vi khuẩn + Nếu áp dụng cách pha 10ml canh thang với các khoanh giấy khác nhau thì mỗi ống nghiệm nhỏ 50µl huyền dịch vi khuẩn
Nồng độ 0,5µg/mL: pha 10mL canh thang + 1 khoanh giấy hàm lượng 5µg colistin sulphate + 50µl huyền dịch vi khuẩn
Nồng độ 1µg/mL: pha 10mL canh thang + 1 khoanh giấy + 50µl huyền dịch vi khuẩn Nồng độ 2µg/mL: pha 10mL canh thang + 2 khoanh giấy+ 50µl huyền dịch vi khuẩn Nồng độ 4µg/mL: pha 10mL canh thang + 4 khoanh giấy + 50µl huyền dịch vi khuẩn Nồng độ 8µg/mL: pha 10mL canh thang + 8 khoanh giấy + 50µl huyền dịch vi khuẩn Nồng độ 16µg/mL: pha 10mL canh thang + 16 khoanh giấy + 50µl huyền dịch vi khuẩn
Nồng độ 0µg/mL: pha 10mL canh thang + 0 khoanh giấy + 50µl huyền dịch vi khuẩn + Vortex các ống để trộn đều vi khuẩn với kháng sinh
Ủ 18 – 24h ở nhiệt độ 370C, rồi đọc kết quả.
2.4.3.5. Quy trình xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng kỹ thuật microdilution [53]:
Hình 2.5. Kỹ thuật microdilution [nguồn: 11]
Chuẩn bị dung dịch kháng sinh pha loãng: nồng độ colistin gốc là 25600
µg/mL. Căn cứ giá trị potency của kháng sinh trên hộp bột kháng sinh và thể tích dung dịch cần pha để tính lượng bột colistin cần lấy, căn cứ theo công thức sau:
Khối lượng (mg) = Hoặc
Thể tích (ml) =
Chuẩn bị đĩa kháng sinh
+ Sử dụng đĩa 96 giếng để pha các dải nồng độ kháng sinh: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0 µg/ml
+ Kháng sinh stock 25600 được pha lỗng đến 64 µg/ml
Cách pha : trộn 50µl dung dịch colistin nồng độ cao với 50 µl canh thang để tạo dải nơng độ pha lỗng bậc 2.
Cấy vi khuẩn vào đĩa kháng sinh: Pha huyền dịch đến 106CFU/ml. Cấy 50
µl huyền dịch 106 CFU/ml vào từng giếng kháng sinh.
Cấy chủng ATCC cùng với các chủng kiểm tra, chứng âm: không cấy vi khuẩn mà sử dụng canh thang, chứng dương là chủng P. aeruginosa kháng colistin MIC =16.
Ủ đĩa kháng sinh với vi khuẩn: ủ 35-370C khí trường bình thường trong 16-18h.
Đọc kết quả:
MIC là nồng độ thấp nhất của một kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 24 giờ nuôi cấy. Quan sát bằng mắt thường, chúng ta dựa vào độc đục của canh thang ni cấy, MIC là giá trị pha lỗng kháng sinh ở ống canh thang mà không quan sát được độ đục của vi khuẩn bắng mắt thường nữa.