Kỹ thuật macrodilution xác định MIC dựa trên thử nghiệm với một số lượng lớn các tế bào vi khuẩn do lượng môi trường canh thang dùng trong thử nghiệm là lớn do đó hạn chế được sai số do chêch lệch nhỏ thể tích mơi trường ni cấy. Phương pháp này được tiến hành với các thao tác kỹ thuật đơn giản, khơng địi hỏi trang thiết bị, sinh phẩm hóa chất phức tạp, ống thủy tinh trong thử nghiệm có thể vơ trùng sau thử nghiệm để tái sử dụng nên giảm chi phí vật tư tiêu hao. Tuy nhiên, trong kỹ thuật này, các thao tác chủ yếu được thực hiện thủ công nên sẽ mất thời gian thao tác, thêm vào đó, lượng mơi trường canh thang, hóa chất sử dụng trong thử nghiệm là lớn hơn nhiều lần so với kỹ thuật microdilution. Kỹ thuật này sử dụng nhiều ống nghiệm thủy tinh cho mỗi thử nghiệm nên cũng yêu cầu diện tích lớn trong tủ ấm.
Hình 3.4: Kỹ thuật macrodilution tiến hành ở 1 chủng với 5 nồng độ kháng sinh khác nhau
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành đồng thời thử nghiệm macrodilution theo hướng dẫn của CLSI M100 và kỹ thuật macrodilution có cải tiến bằng cách thay đổi thể tích mơi trường canh thang ni cấy. Mục đích của cải tiến này là giúp tiết kiệm môi trường canh thang nuôi cấy, đồng thời tiết kiệm diện tích lưu trữ cho thử nghiệm đang tiến hành. Kết quả của chúng tơi thu được là: Khơng có sự khác nhau giữa kết quả so sánh kỹ thuật macrodilution cải tiến và kỹ thuật macrodilution theo đúng khuyến cáo của CLSI với kỹ thuật microdilution. Như vậy, chúng ta hồn tồn có thể sử dụng kỹ thuật macrodilution cải tiến này trong thực tế.
Thêm một nhược điểm của kỹ thuật macrodilution: Hầu hết thực hiện một cách thủ công nên thời gian cho mỗi xét nghiệm sẽ nhiều hơn vì vậy rất tốn thời gian khi cần thực hiện chạy nhiều mẫu đồng thời với một loạt các loại kháng sinh cần thử nghiệm.
Hình 3.5: Chuẩn bị dung dịch kháng sinh colistin với các nồng độ khác nhau.
Tùy thuộc vào điều kiện phòng xét nghiệm, trang thiết bị hiện có, mục đích của thử nghiệm, số lượng thử nghiệm cần thực hiện mà quyết định việc lựa chọn sử dụng kỹ thuật nào.
Bên cạnh nghiên cứu so sánh hai phương pháp trên, nhóm nghiên cứu của chúng tơi hiện tại đang tiếp tục nghiên cứu kiểu gen kháng kháng sinh colistin của các vi khuẩn có trong thử nghiệm. Các gen mà chúng tôi nghiên cứu bao gồm các gen nằm trên nhiễm sắc thể và trên plasmid. Tính đến thời điểm hiện tại, tỉ lệ vi khuẩn trong thử nghiệm (với các chủng đã có kết quả kháng colistin về kiểu hình) có gen mcr-1 là rất nhỏ (chưa tới 5%). Hiện tại, nhóm nghiên cứu của chúng tơi vẫn đang tiếp tục thu thập mẫu và nghiên cứu sâu hơn về tính kháng colistin về đồng thời kiểu gen và kiểu hình.
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được trong q trình nghiên cứu trên chúng tơi rút ra các kết luận như sau:
1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của colistin đối với các vi khuẩn Gram âm đa kháng kháng sinh khi tiến hành bằng kỹ thuật macrodilution có thay đổi và khơng thay đổi thể tích canh thang CAMHB là giống nhau.
2. Tỉ lệ EA và CA giữa 2 kỹ thuật macrodilution và microdilution trong việc xác định MIC của colistin đối với 30 chủng P. aeruginosa đa kháng là 100% và
100%, tỷ lệ này đối với 30 chủng A. baumannii cũng là 100% và 100%, trong khi
đó, đối với 69 chủng Enterobacteriaceae là 91,3% và 100%. Tính chung trong cả nghiên cứu, EA và CA giữa 2 kỹ thuật macrodilution và micodilution trong xác định MIC của colistin với tổng cộng 129 chủng vi khuẩn Gram âm là 95,3% và 100%. Theo hướng dẫn của Cumitech 31A, giá trị EA và CA của phương pháp thử nghiệm với phương pháp tham chiếu đều trên 90% là đủ căn cứ để ứng dụng phương pháp thử nghiệm đó trong lâm sàng.
KIẾN NGHỊ
1. Kỹ thuật macrodilution và kỹ thuật microdilution là hai kỹ thuật có thể đưa vào áp dụng thay thế các kỹ thuật trên trong việc xác định MIC colistin đối với các vi khuẩn Gram âm đa kháng để loại bỏ sai số trong kết quả, nhờ đó mà các bác sỹ lâm sàng có thể chỉ định phác đồ điều trị sử dụng colistin cho bệnh nhân có nhiễm trùng vi khuẩn Gram âm đa kháng với hiệu quả diệt khuẩn là tối đa và tác dụng phụ tối thiểu.
2. Tùy thuộc vào điều kiện phòng xét nghiệm, trang thiết bị hiện có, mục đích của thử nghiệm, số lượng thử nghiệm cần thực hiện mà quyết định việc lựa chọn sử dụng kỹ thuật macrodilution hay microdilution.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Phạm Thị Hoài An (2014), Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella
pneumoniae tại viện pasteur tp. Hồ Chí Minh, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại
học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.
2. Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn sử dụng kháng sinh, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Bộ Y tế (2018), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội,
2018.
4. Lý Ngọc Kính, Ngơ Thị Bích Hà (2011), “Tình hình kháng thuốc kháng sinh
trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số đơn vị điều trị tích cực ở một số cơ sở khám, chữa bệnh”, Tạp chí Dược học, số 5, T. 51.
5. Trần Diệu Linh, Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng carbapenem
của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân tại bệnh viện Việt Đức và bệnh viện Quân Y 108, Luận án tiến sỹ, Hà Nội, 2017.
6. Trường Đại học Y Hà Nội (2014), Vi sinh – Ký sinh trùng lâm sàng, Nhà xuất
bản Y học.
7. Chăn Phon Phôn Ha Vông*; Nguyễn Thái Sơn (2018), “Nghiên cứu đặc điểm
phân bố và mức độ kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh mới nổi, tái nổi tại bệnh viện Quân Y (1-2015 đến 12-2017)”, Tạp chí Y – Dược học quân
sự số 5-2018.
TIẾNG ANH
8. A. Espinel-Ingroff, “Modified Disk Diffusion Assay with Two Broth
Microdilution Reference Assays for Testing Zygomycetes, Aspergillus spp,
Candida spp, and Cryptococcus neoformans with Posaconazole and Amphotericin B”, Journal of Clinical Microbiology, pp 35-41.
10. Balaji Veeraraghavan (2017), “Challenges, Issues and Warnings from CLSI
and EUCAST Working Group on Polymyxin Susceptibility Testing”, Journal
of Clinical and Diagnostic Research, pp 45-48.
11. BioMerieux VITEK 2 Compact Analyzer, www.equipnet.com.
12. Chew KL et al (2017), “Colistin and Polymyxin B Susceptibility Testing for
Carbapenem-Resistant and mcr-Positive Enterobacteriaceae: Comparison of
Sensititre, MicroScan, VITEK 2, and E-test with Broth Microdilution”, J Clin
Microbiol, 55(9):2609-2616.
13. Christian G. Giske et al (2017), “Colistin antimicrobial susceptibility testing – can the slow and challenging be replaced by the rapid and convenient?”,
Clinical Microbiology and Infection, pp 112-118.
14. Christopher Walsh (2003), "Antibiotics: actions, origins, resistance".
15. CLSI (2017), "Performance standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing; Twenty-first informational supplement”. M100-S26. 27th edition,
2017", Washington, D.C, pp 119-221.
16. D. R. Lonsway et al (2007), "Evaluation of methods to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae", Journal of clinical microbiology, 45 (8), pp. 2723-2725.
17. D.Yahav, L.Farbman et al (2012), “Colistin: new lessons on an old antibiotic”,
Clinical Microbiology and Infection, Volume 18, Issue 1, pp 18-29.
18. Daya Choudhary (2017), “Polymyxin B: Uses, Dosage, Side Effects,
Interactions, & Contraindications”.
19. Dietmar Puchberger (2015), “Supplemental Information: Hydrogel-based
microfluidic incubator for microorganism cultivation and analyses”,
ResearchGate. DoctorAlert, pp 54-57.
20. “Efforts to Combat Antibiotic-Resistant Bacteria Through Science”.
21. Erika Matuscheck et al (2018), “Can agar dilution be used for colistin MIC determination?”, ECCMID 28th.
22. Erika Matuschek et al (2017), “Evaluation of five commercial MIC methods for colistin antimicrobial susceptibility testing for Gram-negative bacteria, Eucast Development Laboratory”; Clinical Microbiology, pp 43-49.
23. “E-TEST (Epsilometer test): Principle, purpose, procedure, results and
interpretations”, Microbe Online.
24. E-test®, Bringing On-scale MIC Determination to all Microbiology Labs
(2009), bioMérieux (Clinical Diagnostics).
25. European Medicines Agency (2017), “Antimicrobial resistance”.
26. Feßler AT et al, “Development and evaluation of a broth macrodilution
method to determine the biocide susceptibility of bacteria”, Vet Microbiol.
2018 Sep; 223:59-64.doi: 10.1016/j.vetmic.2018.07.006. Epub 2018 Jul 11.
27. Haeili M, Kafshdouz et al, “Comparison of susceptibility testing methods for
determining the activity of colistin against Gram-negative bacilli of clinical origin”, J Med Microbiol. 2019 Jan;68(1):60-66
28. Herbert Spapen et al (2011), “Renal and neurological side effects of colistin in critically ill patients”, US National Library of Medicine National Institutes of Health, pp 34-43.
29. Herbert Spapen et al (2011), “Renal and neurological side effects of colistin in critically ill patients”, Ann Intensive Care, 1, pp 124-127.
30. Jamie Kisgen (2015), “Lippincott Illustrated Reviews: Pharmacology - Sixth Edition”, Medicine & Health Science Books, pp 114-117.
31. Janet A. Hindler and Romney M. Humphries (2013), “Colistin MIC Variability by Method for Contemporary Clinical Isolates of Multidrug-Resistant Gram- Negative Bacilli”, J Clin Microbiol; 51(6), pp 1678–1684.
32. Janet A. Hindler et al (2013), “Colistin MIC Variability by Method for Contemporary Clinical Isolates of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacilli”, J Clin Microbiol, 51(6): 1678–1684.
33. JM Conly et al (2016), “Colistin: The Phoenix Arises”, National Library of Medicine National Institutes of Health, 17(5): 267–269.
34. Jorgensen JH, “Susceptibility test methods which may be able to predict the emergence of resistance to newer beta- lactam antibiotics”, Chemioterapia.
1985 Feb; 4 (1):7-13.
35. Laura J. Rojas et al (2016), “Colistin Resistance in Carbapenem-Resistant
Klebsiella pneumoniae: Laboratory Detection and Impact on Mortality”, Clin Infect Dis. 2017 Mar 15; 64(6): 711–718.
36. Laurent Dortet et al (2012), "Carbapenem resistance in Enterobacteriaceae:
here is the storm!", Trends in molecular medicine, 18 (5), pp. 263-272.
37. Lo-Ten-Foe JR et al (2007) , “Comparative evaluation of the VITEK 2, disk diffusion, E-test, broth microdilution, and agar dilution susceptibility testing methods for colistin in clinical isolates, including heteroresistant Enterobacter cloacae and Acinetobacter baumannii strains”, pp 128-131.
38. Lucie Bardet et al (2018), “Development of New Tools to Detect Colistin-
Resistance among Enterobacteriaceae Strains”, Canadian Journal of
Infectious Diseases and Medical Microbiology, pp 142-146.
39. Mark A. Toleman Dongeun Yong et al (2009), "Characterization of a New Metallo-β-Lactamase Gene, blaNDM-1, and a Novel Erythromycin Esterase
Gene Carried on a Unique Genetic Structure in Klebsiella pneumoniae
Sequence Type 14 from India", Antimicrobial agents and chemotherapy, 53
(12), pp. 5046-5054.
40. Mark ATolemanet al (2010), "Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study", The Lancet infectious diseases, 10 (9), pp. 597-602. 41. MarketaHoudkova et al (2017), “Evaluation of antibacterial potential and toxicity
of plant volatile compounds using new broth microdilution volatilization method and modified MTT assay”, Fitorapia, 118, 56-62 (36)
42. Matuschek E et al (2017), “Antimicrobial susceptibility testing of colistin - evaluation of seven commercial MIC products against standard broth
microdilution for Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
43. Matuschek E et al (2018), “Antimicrobial susceptibility testing of colistin - evaluation of seven commercial MIC products against standard broth
microdilution for Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, and Acinetobacter spp”, Clin Microbiol Infect, 24(8):865-870.
44. Michael T. Madigan (2014), “Brock Biology of Microorganisms 14th
Edition”.
45. Microbiology in Pictures.com.
46. “Minimum Inhibitory concentration (MIC): Broth dilution method-procedure
and interpretation”, Microbeonline (2013).
47. Mounyr Balouiri et al (2015), “Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 6(2), pp. 18-23. 48. Mushtak T. S. Al-Ouqaili et al (2013), “Detection of Genes Encoding for
Metallo-β-lactamases produced by Resistant Acinetobacter baumannii and
Pseudomonas spp. isolated from Clinical Specimens in Ramadi”, ResearchGate, pp. 27-32.
49. National Center for Biotechnology Information, “Colistin (2019)”.
50. Parijat Daset al (2017), “Colistin: Pharmacology, drug resistance and clinical
applications”, Journal of the academy of clinical microbioligists, 19 (2), pp. 77-85.
51. Patel R, “MALDI-TOF mass spectrometry: transformative proteomics for
clinical microbiology”, Clin Chem 2013; 59: 340–2.
52. Pavlovic M et al, “A dual approach employing MALDI-TOF MS and real-time
PCR for fast species identification within the Enterobacter cloacae complex”, FEMS Microbiol, Lett 2012; 328: 46–53
53. "Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing”, 29th Edition.
54. Pokharel K et al, “Resistance Pattern of Carbapenem on Enterobacteriaceae”,
55. Poornima Ramanan et al, “Colistin Susceptibility Testing of
Enterobacteriaceae by Agar Dilution (AD), Broth Microdilution (BMD) and
Polymyxin NP”, Open Forum Infectious Diseases, Volume 4 (1), pp. 596. 56. Raquel Girardello et al (2016), “Colistin susceptibility testing and VITEK-
2™: is it really useless?”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 91. 57. Richard B Clark et al, “Cumitech 31 a: Verification and Validation of
Procedures in the Clinical Microbiology Laboratory”, American Society for Microbiology, 30 Jan 2009, pp. 143-148.
58. Sarah Kuenzel et al (2012), “Paenibacillus polymyxa”, Michigan State
University, Microbe Wiki.
59. Shamina OV et al, “The comparison of methods for determination of colistin
susceptibility in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae”, Klin Lab
Diagn, 2018; 63(10):646-650.
60. Shelby Sima et al (2017), “Colistin and Polymyxin B Minimal Inhibitory Concentrations Determined by E-test Found Unreliable for Gram-Negative Bacilli”, Ochsner Journal, 17(3):239-242.
61. Tan TY et al (2007), “Comparison of E-test, VITEK and agar dilution for susceptibility testing of colistin”, Clin Microbiol Infect, 13(5):541-4.
62. V Balaji et al (2011), “Polymyxins: Antimicrobial susceptibility concerns and
therapeutic options”, Indian Association of Medical Microbiologists, 29(3),
pp. 230-242.
63. VITEK 2, ProHealth Laboratory.
64. World Health Organization (2017), WHO publishes list of bacteria for which
new antibiotics are urgently needed.
65. Yamuna Devi Bakthavatchalam (2018), “Evaluation of colistin and polymyxin
B susceptibility testing methods in Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii”, J Infect Dev Ctries, 12(6): 504-507.
66. Yi-Hsiang Cheng et al, “Colistin Resistance Mechanisms in Klebsiella
67. Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình, “Kháng sinh – Đề kháng kháng sinh Kỹ thuật kháng sinh đồ Các vấn đề cơ bản thường gặp”, Nhà xuất bản Y học,
2013.
68. Jame H Jorgensen et al, “Antimicrobial Susceptibility Testing: General
Principles and Contemporary Practices”, Clinical Infectious Diseases
1998;26:973–80.
69. Sewell et al, “Comparison of broth macrodilution, broth microdilution, and E test antifungal susceptibility tests for fluconazole”, PubMed Central.
70. Francesco Barchiesi et al, “Comparative Study of Broth Macrodilution and Microdilution Techniques for In Vitro Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts by Using the National Committee for Clinical Laboratory Standards Proposed Standard”, Journal of clinical microbiology, Oct. 1994, pp. 2494-
2500.
71. I Pujol et al, “Comparison study of broth macrodilution and microdilution antifungal susceptibility tests for the filamentous fungi”, Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, 40(9):2106-10.
72. Korean J Clin, “Comparison of Broth Macrodilution and Microdilution in Testing of Minimal Inhibitory”.
73. L. Barth Reller et al, “Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices”, Clinical Infectious Diseases, Volume 49, Issue 11, 1 December 2009, pp. 1749–1755.
74. Sachidevi Puttaswamy et al, “A Comprehensive Review of the Present and Future Antibiotic Susceptibility Testing (AST) Systems”, Archives of Clinical