Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:
- Phần đầu vào: cấp dung mơi pha động có thành phần mong muốn và chuẩn bị mẫu phân tích.
- Phần tách: bao gồm cột tách, đơi khi có cột phụ trợ để bảo vệ cột tách.
- Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detectơ, phần khuếch đại, máy tính và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bao gồm nhiều phƣơng pháp tách chất khác nhau, đó là sắc ký pha ngƣợc; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion; sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử... Phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là sắc ký lỏng pha ngƣợc.
1.6.2. Pha tĩnh trong sắc ký trao đổi ion và cặp ion
Trong HPLC, pha tĩnh (stationary phase) có thể là chất rắn, hoặc là chất lỏng gắn trên vật liệu rắn hoặc xốp tạo nên chất nhồi cột để tách hỗn hợp chất phân tích.Các chất nhồi cột có kích thƣớc hạt rất nhỏ từ 3 – 7 µm. Pha tĩnh dùng trong phân tích HPLC cũng phải thoả mãn những điều kiện cơ bản sau đây:
tách theo đúng bản chất của pha tĩnh và không làm mất chất phân tích khi thực hiện q trình sắc ký trong cột tách.
+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những điều kiện sắc ký nhất định.
+ Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trƣng độ xốp của nó và khơng
bị thay đổi hay biến dạng trong q trình sắc ký, khơng bị phân rã dƣới áp suất cao của quá trình chạy sắc ký.
+ Cân bằng động học của quá trình tách sắc ký phải xẩy ra nhanh, thuận nghịch
và lặp lại tốt; hiệu quả quả tách cao, pic sắc ký cân đối.
+ Cỡ hạt phải tƣơng đối đồng nhất, nghĩa là đƣờng kính của các hạt lớn nhất so
với các hạt nhỏ nhất không chênh lệch nhau quá 10 %, và phải có trên 85 % số hạt phải nằm trong vùng kích thƣớc trung bình. Cột tách nhƣ vậy sẽ có hiệu quả tách cao (số đĩa Nef lớn).
Trong phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion và cặp ion: Pha tĩnh có bề mặt phân cực. Ở đây cơ chế chính ở trong cột tách là sự trao đổi ion giữa những ion trong hỗn hợp mẫu (chất phân tích) và các ion đối (ion trao đổi) của pha tĩnh. Cho nên ở đây tính chất cân bằng trao đổi ion là bản chất của quá trình tách và quyết định đến kết quả tách của cột sắc ký.
1.6.3. Pha động trong sắc ký trao đổi ion và cặp ion
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau: - Pha động phải trơ với pha tĩnh
- Bền vững và khơng bị phân huỷ trong q trình chạy sắc ký - Hồ tan đƣợc mẫu
- Phải có độ tinh khiết cao
- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detectơ - Không quá đắt
Một pha động là một dung mơi hoặc hỗn hợp dung mơi phù hợp góp phần tốt nhất vào quá trình tách chất trên cột. Phù hợp ở đây về độ phân cực, về detectơ cũng nhƣ các tính chất cần thiết khác trong quá trình tách chất.
Trong sắc ký trao đổi ion, pha động là dung dịch nƣớc của các axít, hay bazơ, hoặc là dung dịch nƣớc của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có chứa chất đệm pH, chất cho ion tạo cặp, chất tạo phức. Ví dụ để rửa giải các ion kim loại kiềm và kiềm thổ ra khỏi cột tách chứa pha tĩnh Dowex50-8, ngƣời ta dùng dung dịch nƣớc của NH4CH3COO nồng độ 1 M; và để rửa giải các ion Cu(II), Pb(II), Zn(II), Co(II), Ni(II) ngƣời ta dùng dung dịch axít HNO3 2,5 M. Dung dịch nƣớc của EDTA 0,04 M đến 0,1M có chứa hệ đệm axetat pH= 4,6 để rửa giải các đất hiếm. Trong loại sắc ký này, để tách các ion kim loại chuyển tiếp, các nguyên tố đất hiếm, vai trò pH của pha động và chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn trong quá trình sắc ký .
Thuộc nhóm sắc ký ion, ngồi sắc ký trao đổi cation và ion, cịn có sắc ký cặp ion. Trong sắc ký cặp ion, pha động vẫn dùng dung môi nƣớc và metanol là dung mơi chính. Thêm vào đó là chất chứa ion tạo cặp, chất đệm pH, chất tạo phức.
1.6.4. Detectơ dẫn điện
Nguyên tắc làm việc của detectơ loại này là dựa trên cơ sở đo độ dẫn điện (hay điện trở) của pha động dẫn qua flowcell của detectơ khi có sự hồ tan chất phân tích và khơng có chất phân tích. Việc đo hiệu độ dẫn ở đây là nhờ một cặp điện cực theo nguyên lý của định luật Ôm.
Thực chất của việc đo độ dẫn là đo hiệu số độ dẫn (hay điện trở) giữa pha động khơng hồ tan chất phân tích và có hồ tan chất phân tích. Nghĩa là khi nồng độ C của chất phân tích trong pha động thay đổi thì độ dẫn của nó cũng thay đổi theo. Cặp điện cực dùng trong flowcell của detectơ loại này gồm một điện cực so sánh (calomen hay clorua bạc) và điện cực chỉ thị là một kim loại trơ, nhƣ Pt hay Au.
1.6.5. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC
+ Phân tích định tính
Một trong các đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lƣu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có một thời gian lƣu khác nhau.
Chính đại lƣợng này là một tính chất hay thơng số để định tính các chất có trong một mẫu phân tích.
Vì vậy, sau khi đã chọn đƣợc các điều kiện tối ƣu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lƣu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lƣu của chất phân tích với thời gian lƣu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định đƣợc trong mẫu phân tích có những chất nào.
+ Phân tích định lượng
Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phƣơng pháp là phƣơng pháp đƣờng chuẩn hoặc phƣơng pháp thêm chuẩn để định lƣợng chất phân tích. Việc dùng phƣơng pháp nào trong hai phƣơng pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lƣợng chất phân tích.
Phƣơng pháp đƣờng chuẩn có ƣu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tƣợng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn. Trong trƣờng hợp này để loại trừ ảnh hƣởng của nền, ngƣời ta dùng phƣơng pháp thêm chuẩn.
1.7. Phƣơng pháp đánh giá rủi ro sức khỏe con ngƣời
Đánh giá rủi ro sức khỏe là đánh giá các mối nguy hại tiềm tàng ảnh hƣởng đến sức khỏe khi con ngƣời phơi nhiễm các hóa chất độc hại. Đánh giá phơi nhiễm đƣợc xem xét trong mối quan hệ với các loại hoặc mức độ độc của chất hóa học, cho phép đánh giá rủi ro sức khỏe, đến rủi ro đối với cộng đồng hiện tại và tƣơng lại [6].
Đánh giá rủi ro sức khỏe thực hiện theo các bƣớc sau: + Nhận biết mối nguy hại;
+ Đánh giá phơi nhiễm; + Đánh giá độc tính; + Xác định đặc tính rủi ro; + Mô tả rủi ro.