2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu được tiến hành từ: năm 2014 đến 2015
Địa điểm nghiên cứu: Tại phịng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu nghiên cứu: Cỡ mẫu toàn bộ bao gồm 582 chủng A. baumannii thu
thập được từ 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn từ năm 2010 đến năm 2014. Các chủng A. baumannii được phân lập từ các bệnh phẩm nhiễm khuẩn như: máu, đờm khí quản, nước tiểu, dịch vết mổ …
2.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.6.1. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh
2.6.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch
Được thực hiện tại khoa vi sinh của 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn. Dựa trên nguyên lý là kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào đĩa thạch Mueller-hinton đã được láng đều các chủng vi khuẩn cần thử nghiệm. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh sẽ được biểu hiện bằng đường kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Đường kính các vịng vơ khuẩn thu được sẽ được ghi lại và tính tốn dựa theo tiêu chuẩn CLSI, năm 2010. Các loại khoanh giấy kháng sinh sử dụng bao gồm imipenem (IMP), meropenem
(MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli
ATCC-25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm [20]. Sau khi thực hiện thử nghiệm, các chủng vi khuẩn kháng với carbapenem sẽ được ghi lại, lập danh sách cụ thể và gửi về phịng thí nghiệm Kháng sinh- Khoa Vi khuẩn-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để tiếp tục thực hiện các thử nghiệm tiếp theo phục vụ cho nghiên cứu.
2.6.1.2. Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) (MIC)
Kỹ thuật MIC được thực hiện tại phịng thí nghiệm Kháng sinh- Khoa Vi khuẩn-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller-hinton có nồng độ kháng sinh khác nhau theo tiêu chuẩn của CLSI và được ủ ở 37oC qua đêm (khoảng 18 giờ). Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc 3. Các kháng sinh được thử nghiệm bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-
25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm [20].
2.6.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử
2.6.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn mang gen NDM-1
Tế bào vi khuẩn ly giải toàn phần trong nước cất vô trùng bằng phương pháp tách nhiệt ở 95oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ cặn và giữ lại nước nổi có chứa DNA để sử dụng làm khuôn mẫu cho kỹ thuật PCR phát hiện các gen NDM-1.Các đoạn mồi sử dụng cho kỹ thuật được trình bày tại Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Trình tự mồi để phát hiện gen NDM-1 của vi khuẩn [79] TT Tên Trình tự mồi Kích thƣớc (bp) Ndm1-F 5’-atgcacccggtcgcgaagctgag-3’ 499 Ndm1-R 5’-ttcgacccagccattggcggcga-3’
Quy trình tách chiết DNA của vi khuẩn: Vi khuẩn được xác định là chủng thuần và được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng. Lấy 3-5 khuẩn lạc vi khuẩn, hòa đều vào 200µl nước cất vơ trùng đựng trong tube ly tâm vô trùng. Đun cách thủy ở 95oC/ 5 phút sau đó ly tâm 13.000 vịng/ 10 phút và loại bỏ cặn, thu nước nổi làm khuân mẫu DNA cho phản ứng PCR.
Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên thạch điện di agarose nồng độ 1,5% trong đệm TAE 1X trong 30 phút. Sau khi điện di xong gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromine nồng độ 10mg/ml trong 10 phút, rửa trong nước cất 15 phút. Gel được mang đi quan sát và chụp lại bằng máy chụp ảnh gel.
Phân tích kết quả: Sau khi thu được ảnh chụp, các chủng vi khuẩn xuất hiện band sẽ được so sánh với kích thước band của chứng dương để kết luận chúng có dương tính với gen NDM-1 hay khơng.
2.6.2.2. Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử bằng kỹ thuật multilocus sequence typing (MLST) sequence typing (MLST)
Phương pháp của Bartual và cộng sự sẽ được áp dụng để tiến hành kỹ thuật MLST. Trong kỹ thuật MLST, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sau đó tiến hành
giải trình tự. Số lượng Allele sẽ phân loại các ST (sequence type) sau khi số liệu này được gửi vào dedicated data- base (http://pubmlst.org). Các dữ liệu về Allele của 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sẽ được phân
tích trên cơ sở dữ liệu về MLST của Acinetobacter baumannii
http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_abaumannii_oxford_seqdef
Bảng 2.2. Các trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật MLST đối với chủng A.
baumannii [11] TT Tên Trình tự mồi Kích thƣớc (bp) Tài liệu tham khảo 1
gltA -F AAT TTA CAG TGG CAC ATT AGG TCC C
772
A. baumannii
MLST website gltA -R GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA
CAC G
2
gyrB -F TGA AGG CGG CTT ATC TGA GT
594 gyrB -R GCT GGG TCT TTT TCC TGA CA
3
gdhB -F GCT ACT TTT ATG CAA CAG AGC C
774 gdhB -R GTT GAG TTG GCG TAT GTT GTG C
4
recA -F CCT GAA TCT TCY GGT AAA AC
425 recA -R GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC
5
cpn60-F GGT GCT CAA CTT GTT CGT GA
640 cpn60-R CAC CGA AAC CAG GAG CTT TA
6
gpi-F GAA ATT TCC GGA GCT CAC AA
456 gpi-R TCA GGA GCA ATA CCC CAC TC
7
rpoD -F ACC CGT GAA GGT GAA ATC AG
672 rpoD -R TTC AGC TGG AGC TTT AGC AAT
Sau khi chạy PCR với 7 cặp mồi cho kỹ thuật MLST, sản phẩm PCR sẽ được mang đi tinh sạch bằng bộ kit DNA Gel purification (QIAGEN).Thực hiện phản ứng Bigdye – PCR
- Tinh sạch sản phẩm DNA: Cho 45 µl Sam solution và 10 µl X-termination/ mẫu bệnh phẩm. Lắc 2000 vịng/30 phút, ly tâm 3000 vòng trong 2-3 phút lấy nước nổi cho vào máy giải trình tự gen.
- Đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied Biosystem, Mỹ). - Phân tích trình tự gen: So sánh các đoạn gen với các trình tự chuẩn của ngân hàng gen trên website của đơn vị nghiên cứu Oxford http://pubmlst.org
2.6.2.3. Phân tích mối liên hệ kiểu gen các chủng A. baumannii bằng kỹ
thuật PFGE [39]
Tách DNA vi khuẩn trong đệm thạch:
- Lấy một khuẩn lạc của các chủng A. baumannii và chủng vi khuẩn
Braenderup H9812 (chủng chuẩn) trên đĩa thạch Mueller-hinton được nuôi
cấy qua đêm ở 37oC cấy vào ống canh thang LB, ủ ở 37oC qua đêm
- Hút canh khuẩn vào tube ly tâm 1.5ml, ly tâm 8000vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ nước nổi, rửa cặn bằng TE 1X sau đó ly tâm 8000vịng/phút trong 5 phút. Giữ lại cặn và hồn ngun vào 500 µl CSB, bổ sung protein K (20mg/ml) và đảo nhẹ bằng pipet.
- Bổ sung SGA-SDS 1% vào hỗn dịch vi khuẩn, trộn đều, sau đó nhỏ hỗn dịch vào khn tạo plug, để ở nhiệt độ phịng khoảng 10-15 phút cho đông.
- ly giải tế bào vi khuẩn bằng dung dịch CLB (1mg/ml protein K, 1% N- lauroylsarcosin trong 0.5M EDTA pH 8.0), bổ sung 30µl proiein K (20mg/ml) lắc nhẹ trong bể ủ nhiệt ở 55o C qua đêm.
Rửa plug sau khi ly giải:
- Loại bỏ nước ly giải tế bào, rửa plug bằng nước khử ion vô trùng 2 lần mỗi lẫn 15 phút ở 55oC. Thực hiện bước rửa tương tự bằng TE 1 X sau đó giữ plug trong TE 1X ở 4oC tới khi sử dụng.
Cắt DNA vi khuẩn bằng enzyme cắt giới hạn:
- Cắt chromosomal DNA của vi khuẩn đã tách chiết trong thạch bằng Enzym giới hạn XbaI (đối với chủng chuẩn Braenderup H9812 ) và ApaI (cho A.
baumannii) nồng độ 30UI/ miếng thạch ở 370C trong vòng 12-16 giờ.
- Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1%, ở hiệu điện thế 6V/cm trong 19 giờ ở nhiệt độ 140C, thời gian một xung từ 25 đến 60s và góc điện trường là 120 độ.
2.6.2.4. Phát hiện plasmid mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật Southern-Blotting [39] Blotting [39]
Tạo mẫu dò cho gen NDM-1:
- Khuếch đại đoạn gen NDM-1 bằng phản ứng PCR.
- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng tinh sach DNA (high pure product purification kik – Roche)
- Biến tính 100 ng DNA ở 100oC trong 5 phút sau đó làm lạnh tức thì bằng cách vùi vào đá dắm trong 10 phút.
- Tạo mẫu dị bằng bộ kít ECLTM Amersham
- Sản phẩm NDM-1 sau khi đánh dấu nếu khơng sử dụng ngay có thể được giữ ở trong 30% glycerol ở -15 đến -300C trong 6 tháng.
Tách chiết DNA vi khuẩn trong đệm thạch (giống với phương pháp PFGE ở phần 2.6.2.3)
Thực hiện kỹ thuật S1-PFGE:
- Cắt loại bỏ DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn bằng enzym S1 nồng độ 20UI/200µl dung dịch đệm enzym S1, Ủ 370C trong 1 giờ.
- Chủng S. braenderup H9812 sử dụng làm thang DNA chuẩn được cắt bằng enzym XbaI, 30UI/phản ứng ở 370C trong 3 giờ.
- Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1% để tách plasmid.
- Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và chụp ảnh để xác định số lượng và kích thước plasmid của các chủng vi khuẩn.
Chuyển DNA plasmid sang màng lai Hybond-N, Amersham:
- Rửa gel bằng dung dịch HCL 0,25M lạnh trong 7 phút, dung dịch biến tính (NaCl 1,5M; NaOH 0,5M) lạnh trong 20 phút và dung dịch trung hòa (Tris- HCl 0,5M; NaCl 1,5M; pH 7.5) lạnh trong 20 phút.
- Chuyển các plasmid sang màng lai Hybond-N của hãng Amersham bằng dung dịch chuyển màng SSC 20X (3 M NaCl, 300 mM Natri Citrate, pH 7.0) bằng hệ thống chuyển màng Biometra-analytic (của hãng Jena, Cộng hòa Pháp).
Thực hiện phản ứng lai:
- Màng lai đặt ủ trong dung dịch tiền lai (gold hydridization buffer của hãng ECLTM Amersham) ở 42oC trong 1 giờ.
- Loại bỏ dung dịch tiền lai đưa vào dung dịch lai đã được bổ sung 30 µl mẫu dị NDM-1.
- Lai qua đêm ở 42o
C (khoảng 16 giờ) bằng lò lai UPV HL-2000 HybriLinker (Đức).
- Dừng phản ứng lại và rửa màng lai bằng dung dịch SSC 0,5X chứa 0,4% SDS và dung dịch SSC 2X ở 55oC.
Hiện màng (sử dụng bộ Kit ECl, Hãng ECLTM Amersham):
- Hiện màng trên hyper film bằng hỗn hợp detection 1 và detection 2 ECLTM Amersham.
Phân tích kết quả: Sử dụng ảnh chụp gen các plasmid trước khi và ảnh plasmid sau
khi lai để phát hiện số lượng và kích thước các plasmid mang gen.
2.7. Quản lý và phân tích số liệu
- Số liệu thu thập được từ phiếu điều tra và bệnh án sẽ được nhập 2 lần độc lập vào máy tính và kiểm tra đối chiếu để tránh sai sót trong q trình nhập số liệu. Số liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm excel. Kết quả được trình bày dưới dạng bảng, đồ thị, biểu đồ
- Phần mềm Bioedit và website của đơn vị nghiên cứu Oxford http://pubmlst.org được sử dụng để đọc và phân tích kết quả MLST.
- Phân tích mối liên hệ kiểu gen của các chủng A. baumannii kháng
carbapenem mang gen NDM-1 bằng phần mềm Bionumeric- 6.5 để tạo cây phả hệ.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Mô tả thực trạng kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn
Trong 5 năm, từ năm 2010 đến năm 2014 nghiên cứu đã thu thập được 582 chủng A. baumannii kháng carbapenem tại 3 bệnh viện ở Hà Nội, năm 2010 thu thập được 34 chủng A. baumannii, năm 2011 là 220 chủng; năm 2012 là 279 chủng; năm 2013 là 47 chủng và năm 2014 là 2 chủng. Trong đó có 55 chủng thu tập tại bệnh viện Xanh Pơn, 106 chủng ở bệnh viện Thanh Nhàn và 421 chủng ở bệnh viện Việt Đức (Hình 3.1).
Hình 3.1. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem tại 3 bệnh viện theo năm (n=582)
Trong 582 chủng A. baumannii phân lập được tại 3 bệnh viện, có 428 chủng được phát hiện ở nam giới chiếm khoảng 74% và 154 chủng phát hiện ở nữ giới chiếm khoảng 26% tổng số trường hợp (tỷ suất chênh Nam/nữ=2,78). Qua đó cho thấy tỷ lệ nam giới nhiễm vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem cao hơn nữ giới rất nhiều (Hình 3.2). 15 153 217 35 1 14 31 49 12 0 5 36 13 0 1 0 50 100 150 200 250 2010 2011 2012 2013 2014
Việt Đức Tha nh Nhà n Xa nh Pơn
Số
C
hủ
Hình 3.2. Tỷ lệ phân bố của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem 3 bệnh viện theo giới (n=582)
Tỷ lệ về giới được thể hiện rõ hơn đối với từng bệnh viện trong biểu đồ tỷ lệ phân bố theo giới phát hiện các chủng A. baumannii kháng carbapenem (Hình 3.3).
Hình 3.3. Phân bố theo giới của các chủng A. baumannii kháng carbapenem trong từng bệnh viện (n=582) 428 154 Nam Nữ 26 % 74 % 320 69 39 101 37 16 0 50 100 150 200 250 300 350
Việt Đức Thanh Nhàn Xanh Pôn Nam Nữ
Tỷ lệ bệnh nhân nam nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn A. baumannii
kháng carbapenem cao hơn nhiều so với bệnh nhân nữ ở từng bệnh viện (Hình 3.3). Trong những năm gần đây, tình trạng vi khuẩn Gram âm kháng kháng sinh gây nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề cấp thiết đối với ngành y tế Việt Nam. Trong đó vi khuẩn A. baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện chiếm một tỷ lệ cao so với các vi khuẩn khác. Ở các nghiên cứu gần đây của chúng tôi cho thấy, tỷ lệ A.
baumannii kháng kháng sinh gây nhiễm khuẩn bệnh viện chiếm tới hơn 50% ở 3
bệnh viện lớn tại Hà Nội là bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn. Đa số các chủng trong nghiên cứu đã kháng lại cephalosporin và với ít nhất 1 kháng sinh thuộc nhóm carbapenem. Ở nghiên cứu này, toàn bộ 582 chủng A. baumannii đều
kháng lại với ít nhất một kháng sinh thuộc nhóm carbapenem. Điều này cho thấy tình trạng A. baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện kháng carbapenem ở các bệnh viện ngày càng tăng cao và trở thành tình trạng báo động đối với hệ thống Y tế.
3.2. Phát hiện tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập đƣợc trong nghiên cứu NDM-1 phân lập đƣợc trong nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NDM-1 (Ndm1-F: 5’-atgcacccggtcgcgaagctgag-3’; Ndm1-R: 5’- ttcgacccagccattggcggcga-3’) để phát hiện các chủng A. baumannii kháng
Hình 3.4. Hình ảnh đại diện cho các chủng vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 trong nghiên cứu. P: positive; N: negative; M: thang chuẩn 100bp
Giếng số1: 36VĐ; 2: 103VĐ; 3: 89VĐ; 4: 340TN; 5: 93VĐ; 6: 76SP; 7: 271SP; 8:
275SP; 9: 40TN; 10: 303VĐ; 11: 42TN; 12: 77TN; 13: 94VĐ; 14: 95VĐ; 15:
103VĐ; 16: 107TN; 17: 320TN; 18: 111SP
Kết quả cho thấy 23/582 chủng A. baumannii, được phát hiện dương tính với gen NDM-1 chiếm khoảng 3,95% tổng số chủng thu thập được.
Hình 3.5. Tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem trong nghiên cứu (n=582)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 P N 3000 500 300 200 100 1500 Size (bp) 499bp Dương tính:23; 3.95% Âm tính: 559; 96.05% Dương tính Âm tính
3.2.1. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 phân lập tại 3 bệnh viện
Trong 23 chủng A. baumannii mang gen NDM-1, có 7 chủng được phân lập từ bệnh viện Việt Đức, 5 chủng phân lập được ở bệnh viện Thanh Nhàn và 11 chủng phân lập tại bệnh viện Xanh Pơn.
Hình 3.6. Tỷ lệ phân bố A. baumannii mang gen NDM-1 ở 3 bệnh viện (n=23)
3.2.2. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 theo khoa
Sự phân bố theo khoa của các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 được thể hiện trong biểu đồ ở Hình 3.7. Tại bệnh viện Việt Đức, 7 chủng A. baumannii