CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn A baumannii mang
mang gen NDM-1
3.3.1. Kiểu gen PFGE của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 carbapenem mang gen NDM-1
DNA của các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 được xử lý bằng
enzyme ApaI sau đó chạy điện di xung trường trong 19 giờ. Kết quả được đọc bằng máy Biodoc và được phân tích bằng phần mềm BioNumerics.
Hình 3.10. Hình ảnh đại diện cho kiểu gen PFGE của một số chủng A.
baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem trong nghiên cứu
Giếng số 1: 65/SP/2010; 2: 275/Sp/2011; 3: 282/SP/2011; 4: 303VD/2011; 5: 320/TN/2011; 6: 327/SP/2011; 7: 351/SP/2011; 8: 357/SP/2011; 9: 650/SP/2012; 10: 821/VD/2012; 11: 856/VD/2012; 12: 1057/VD/2012. M: thang DNA chuẩn S.
braenderup H9812 M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 M 668.9 452.7 Size (kb) 398.4 310.1 173.4 138.9 78.2 54.7 33.3
Hình 3.11. Cây phân loại kiểu gen PFGE của các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem Apa I 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 Apa I 1539 340 1191 1105 1398 1146 303 320 1057 856 351 357 393 650 327 275 282 271 65 947 1267 1413 821 Saint Paul Thanh Nhan Viet Duc Thanh Nhan Thanh Nhan Thanh Nhan Viet Duc Thanh Nhan Viet Duc Viet Duc Saint Paul Saint Paul Saint Paul Saint Paul Saint Paul Saint Paul Saint Paul Saint Paul Saint Paul Saint Paul Viet Duc Viet Duc Viet Duc 2014 2011 2013 2013 2013 2013 2011 2011 2012 2012 2011 2011 2011 2012 2011 2011 2011 2011 2010 2012 2013 2013 2012 I III IV II
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi phân tích 23 chủng A. baumannii mang gen NDM-1 bằng kỹ thuật PFGE, có thể chia ra thành 4 nhóm chính (Hình 3.11). Nhóm I, Nhóm II, Nhóm III và Nhóm IV với mức độ tương đồng của Nhóm I, II, III khoảng 90% và độ tương đồng của nhóm IV là 100%. Nhóm I bao gồm 3 chủng (1105TN, 1398TN, 1146TN) được phân lập từ bệnh viện Thanh Nhàn năm 2013 .Nhóm II gồm 2 chủng 303VD và 320TN được phân lập ở bệnh viện Việt Đức và bệnh viện Thanh Nhàn năm 2011. Nhóm III gồm 8 chủng (351XP, 357XP, 393XP, 650XP, 327XP, 275XP, 282XP, 271XP) phân lập được tại bệnh viện Xanh Pơn từ năm 2011 và 2012. Nhóm IV gồm 2 chủng 1267VD và 1413VD phân lập được tại bệnh viện Việt Đức năm 2013. Ở nhóm III, 2 cặp chủng (351XP, 357XP) và (275XP, 282XP) có kiểu gen PFGE giống nhau hồn tồn. Qua phiếu điều tra bệnh án, chúng tôi phát hiện các chủng này đều được phân lập từ Khoa Nhi, bệnh viện Xanh Pôn. Bên cạnh đó, Nhóm IV gồm 2 chủng 1267VD ở khoa Hồi Sức và 1413VD khoa Phẫu thuật nhiễm khuẩn bệnh viện Việt Đức cũng có sự tương đồng về kiều gen PFGE là 100%.
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, các chủng A. baumannii mang gen
NDM-1 kháng carbapenem không thuộc cùng một kiểu gen duy nhất (single clone) mà có sự đa dạng về kiểu gen [70]. Trong nghiên cứu này cũng vậy kết quả PFGE cho thấy kiểu gen của các chủng A. baumannii phân lập được chia ra làm các nhóm khác nhau và có sự tương đồng với tỷ lệ nhất định. Ngoài ra có một số chủng A. baumannii có kiểu gen khác hồn tồn so với những chủng cịn lại. Điều đó chứng
tỏ sự đa dạng về mặt kiểu gen của những chủng A. baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện. Quan trọng nhất là nghiên cứu đã phát hiện được 4 nhóm vi khuẩn có độ tương đồng trên 90% trong đó có 3 cặp vi khuẩn phân lập được có kiểu gen tương đồng nhau 100% (2 cặp ở Xanh Pôn và 1 cặp ở Việt Đức) cho thấy có mối liên hệ về chủng A. baumannii giữa các bệnh nhân trong cùng một khoa (Khoa Nhi – Xanh Pôn) và giữa các khoa khác nhau trong cùng bệnh viện (Khoa Hồi sức và Khoa Phẫu thuật nhiễm khuẩn – Việt Đức). Điều này chứng tỏ đã có sự lây lan các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 giữa các khoa
trong bệnh viện (Xanh Pôn, Việt Đức) và có sự liên hệ giữa các chủng A. baumannii ở 2 bệnh viện Việt Đức và Thanh Nhàn (Nhóm II). Hiện nay kỹ thuật PFGE được sử dụng nhiều để nghiên cứu và đánh giá sự lây truyền giữa các vi khuẩn gây bệnh trọng bệnh viện cũng như trong cộng đồng.
3.3.2. Phát hiện plasmid mang gen NDM-1
Trong nghiên cứu này enzym S1 được sử dụng để loại bỏ các DNA mạch thẳng và giữ lại các plasmid mạch vịng sau đó điện di bằng kỹ thuật PFGE và chuyển sang màng lai. Màng lai có chứa các plasmid sẽ được lai với đầu dò đặc hiệu để phát hiện các plasmid mang gen NDM-1.
Kết quả Southern blotting cho thấy chỉ có một chủng phân lập có chứa một plasmid mang gen NDM-1. Kích thước plasmid này khoảng 50kb và thuộc về type N-repA (Hình 3.12). Hầu hết các chủng A. baumannii dương tính với NDM-1 đều có gen NDM-1 nằm trên nhiễm sắc thể khi chúng tơi tiến hành thí nghiệm Southern blotting với enzyme IceuI (loại enzym cắt dùng cho nhiễm sắc thể dùng trong thí nghiệm Southern blotting).
Hình 3.12. Kết quả đại diện phát hiện plasmid mang gen NDM-1 trên một số
ChủngE.Cloaceae có
plasmid mang gen NDM-1 phânlập tại BV Việt Đức ChủngE.Cloaceae có
plasmid mang gen NDM-1 phânlập tại BV Việt Đức
Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Thanh Nhàn Bệnh viện Xanh Pôn M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 668.9 452.7 Size (kb) 398.4 310.1 173.4 138.9 78.2 54.7 33.3 (A) (B)
A: Ảnh điện di xung trường các plasmid của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem
mang gen NDM-1 sau khi xử lý bằng enzym S1, M: chủng marker Braenderup
H9812 đã được xác định kích thước các band DNA (kb).
B: Plasmid mang gen NDM-1 của các chủng vi khuẩn được phát hiện sau khi được
lai với các đoạn dò NDM-1 đặc hiệu.
Giếng số 1: 303VĐ; 2: 1057VĐ; 3: 1267VĐ; 4: 320TN; 5: 1105TN; 6: 1146TN; 7: 65XP; 8: 275XP; 9: 327XP; 10:351XP; 11:357XP; 12: 650XP; 13: 947XP; 14: 53VĐ (E. cloaceae làm chứng dương)
Trong nghiên cứu này, chỉ phát hiện một chủng A. baumannii phân lập tại
bệnh viện Thanh Nhàn có một plasmid với kích thước khoảng 50kb tương đồng với một số plasmid của các chủng vi khuẩn đường ruột mang gen NDM-1 phân lập tại bệnh viện Việt Đức [3].Trong khi đó ở nghiên cứu về vi khuẩn đường ruột gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM-1 kháng carbapenem cũng tại ba bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn của tác giả Trần Huy Hoàng và cộng sự, đa số các chủng dương tính với NDM-1 đều có một hoặc nhiều Plasmid mang gen NDM- 1 [3]. Có thể lý giải cho sự khác nhau này như sau, chủng A. baumannii có sự khác biệt với các chủng vi khuẩn đường ruột Gram âm ở hệ thống porin (kênh protein màng). Hệ thống porin của A. baumannii ít và nhỏ hơn so với các vi khuẩn đường ruột Gram âm vì vậy nó cũng hạn chế các plasmid đi qua màng tế bào thông qua con đường tiếp hợp để truyền các plasmid mang gen kháng kháng sinh ra ngồi. Tuy nhiên có plasmid mang gen NDM-1 chứng tỏ đã có sự truyền plasmid từ các chủng vi khuẩn đường ruột sang A. baumannii.
3.3.3. Kỹ thuật multilocus sequence typing xác định kiểu gen các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 khuẩn A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1
Kỹ thuật này được thực hiện bằng phản ứng PCR với 7 cặp mồi bao gồm:
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 1: 65 SP 2: 947 SP 3: 1057 VD 4: 1105 TN 5: 1146 TN 6: 1191 VD 7: 1267 VD 8: 1398 TN 9: 1413 VD 10: 1539 SP
gltA gyrB recA
3000 500 300 200 100 1500 Size (bp) 772 bp 594 bp 425 bp 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 1: 65 SP 2: 947 SP 3: 1057 VD 4: 1105 TN 5: 1146 TN 6: 1191 VD 7: 1267 VD 8: 1398 TN 9: 1413 VD 10: 1539 SP cpn60 gpi rpoD recA 640 bp 672 bp 456 bp M 5 6 7 8 9 10 rpoD 1: 65 SP 2: 947 SP 3: 1057 VD 4: 1105 TN 5: 1146 TN 6: 1191 VD 7: 1267 VD 8: 1398 TN 9: 1413 VD 10: 1539 SP
Sau khi điện di xác định kết quả của phản ứng PCR, sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và mang đi giải trình tự bằng máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied Biosystem, Mỹ). Kết quả giải trình tự sẽ được đọc và phân tích bằng phần mềm Bioedit và website http://pubmlst.org
Bảng 3.2. Phân tích kết quả MLST các chủng A. baumannii
Chúng tơi đã tiến hành giải trình tự song song giữa các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 và chủng không mang gen NDM-1 phân lập được từ 3 bệnh viện (Bảng 3.2). Đối với 12 chủng dương tính với NDM-1 trong nghiên cứu, có tới 5 kiểu trình tự (ST) mới được phát hiện và được chia làm 5 nhóm (clonal complex) gồm nhóm A, B, C, D và CC92. Trong 11 chủng âm tính với NDM-1, có 3 kiểu trình tự mới được tìm thấy và được chia làm 4 nhóm gồm CC92, E, CC109, F.
Kết quả MLST phát hiện được 8 chủng thuộc các kiểu trình tự đã biết, cịn lại đều là các kiểu trình tự mới chưa được công bố trên thế giới. Điều này có thể được giải thích là do việc sử dụng kháng sinh nhóm carbapenem tại Việt Nam đã
tạo ra áp lực chọn lọc cho A. baumannii tiến hóa theo một hướng riêng khơng giống với các nơi khác trên thế giới. Nghiên cứu có 5 chủng thuộc 2 nhóm đã được cơng bố trên thế giới là nhóm CC92 và CC109 là hai nhóm gây dịch bệnh trên thế giới [34]. Đây là những phát hiện quan trọng cho thấy 3 bệnh viện ở Việt Nam đã xuất hiện những chủng A. baumannii có nguy cơ gây dịch và đồng thời cũng xuất hiện
các chủng mới dưới áp lực của việc điều trị nhiễm khuẩn bằng kháng sinh, điều này trở thành áp lực lớn đối với ngành y tế trong cơng tác phịng chống và điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện.
Đặc biệt, khi ta so sánh 12 chủng phân lập mang gen NDM-1 với 11 chủng âm tính với gen này, ở các chủng mang gen NDM-1, số kiểu trình tự mới được phát hiện nhiều hơn hẳn so với các chủng âm tính với NDM-1. Quan trọng hơn là ở tất cả 6 chủng thuộc novel 1 nằm ở bệnh viện Xanh Pơn và tìm thấy các allele giống nhau hồn tồn, điều đó cho thấy có mối liên hệ giữa các chủng gây nhiễm trùng bệnh viện này với nhau. Bên cạnh đó 2 chủng thuộc ST 302 có một chủng phân lập ở Việt Đức và một chủng phân lập ở Xanh Pơn cũng có các allele giống nhau, có thể thấy rằng đây phải là một chủng có đặc trưng riêng gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện. Để đi đến một kết luận chính xác, chi tiết hơn cần phải tiến hành điều tra thêm về các yếu tố dịch tễ học lâm sàng và nghiên cứu sâu hơn các kỹ thuật sinh học phân tử.
3.4. Hƣớng nghiên cứu tiếp theo
Từ lần đầu tiên phát hiện ra vi khuẩn mang gen NDM-1, trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về loại gen kháng siêu kháng thuốc này. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu chúng tơi cũng đã tiến hành được một số nghiên cứu quan trọng và là nhóm nghiên cứu đầu tiền phát hiện ra vi khuẩn mang gen NDM-1. Trong nghiên cứu này, các chủng A. baumannii được thu thập từ năm 2010 đền năm 2014 và được tiến hành thử nghiệm bằng nhiều phương pháp nghiên cứu truyền thống cũng như phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Nghiên cứu đã đưa ra được các bằng chứng về sự có mặt của vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 kháng
carbapenem tại ba bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn là ba bệnh viện lớn ở Hà Nội. Nghiên cứu đã đưa ra được mức độ kháng thuốc của các chủng vi khuẩn này là rất cao đối với nhiều nhóm kháng sinh mạnh bao gồm carbapenem, cephalosporin và fluoroquinolone. Các phương pháp sinh học phân tử (PCR, PFGE, Southern blotting, MLST) đã được áp dụng vào trong nghiên cứu đã chỉ ra được tỷ
lệ A. baumannii mang gen NDM-1, tính đa dang về mặt kiểu gen qua đó nêu lên
được nguy cơ về kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng như áp lực đối với ngành y tế trong việc nghiên cứu và tìm ra phương pháp điều trị hiệu quả cho vi khuẩn kháng thuốc.
Tuy nhiên, nghiên cứu này vẫn còn một số hạn chế do giới hạn về thời gian nghiên cứu, kinh phí thực hiện và trong khuôn khổ của một luận văn thạc sĩ không cho phép thực hiện tồn bộ và chun sâu các nghiên cứu về khía cạnh dịch tễ học lâm sàng và sinh học phân tử. Kết quả nghiên cứu cho thấy còn một lượng lớn các chủng A. baumannii trong nghiên cứu âm tính với gen NDM-1, điều này có nghĩa là ngồi gen NDM-1 kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem mà cịn nhiều gen khác qui định tính kháng thuốc của vi khuẩn này như OXA 23, OXA 51, OXA 58…Do vậy cần có thêm những nghiên cứu về cơ chế kháng kháng sinh của nhiều loại gen khác, qua đó chúng ta có thể hiểu hơn về cơ chế cũng như tính đa dạng của vi khuẩn kháng carbapenem.
KẾT LUẬN
1. Tình trạng kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii kháng
carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn
Đã phát hiện số lượng lớn các chủng vi khuẩn A. baumannii (582 chủng) kháng carbapenem trên tổng số các chủng vi khuẩn kháng carbapenem ở 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn thu thập trong 5 năm từ năm 2010 đến 2014.
Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm A. baumannii kháng carbapenem ở nam giới cao hơn nhiều so với nữ giới (74%, và 26%).
2. Tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1 phân lập đƣợc trong
nghiên cứu
23/582 A. baumannii kháng carbapenem có kết quả dương tính với gen
NDM-1 chiếm tỷ lệ 3,95 %.
Các chủng mang gen NDM-1 phân lập được trên các bệnh nhân thuộc nhiều nhóm tuổi, cao nhất là ở trẻ nhỏ dưới 10 tuổi được phát hiện ở bệnh viện Xanh Pơn. Tỷ lệ phân lập theo giới cũng có sự chênh lệch đáng kể khi nam giới chiếm tới 87% so với 13% nữ giới (tỷ suất chênh là 6,67). Kết quả MIC cho thấy các chủng A. baumannii mang gen NDM-1 kháng
lại kháng sinh với tỷ lệ cao: 95,6% với imipenem (8- 256mg/L) và meropenem (8-128mg/L); 100% kháng cefotaxime (>64mg/L) và ceftazidime (>32mg/L), 52,5% kháng lại ciprofloxacin (>4mg/L). Tuy nhiên 100% số chủng vẫn còn nhạy cảm với colistin.
3. Một số đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM-1
Bốn chủng phân lập được tại bệnh viện Xanh Pôn và hai chủng phân lập được tại bệnh viện Việt Đức có sự tương đồng hoàn toàn về kiểu gen PFGE.
Chủng A. baumannii 1146TN phân lập tại bệnh viện Thanh Nhàn phát
hiện được một plasmid mang gen NDM-1 có kích thước khoảng 50kb.
Kết quả MLST cho thấy chỉ có 1 chủng A. baumannii mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức nằm trong nhóm CC92 gây dịch trên thế giới, các chủng cịn lại đều có kiểu trình tự gen khơng giống với kiểu trình tự gen đã được công bố trên hệ thống MLST trong ngân hàng gen thế giới.
KIẾN NGHỊ
Đối với 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn:
Cần tiếp tục giám sát tình trạng vi khuẩn A. baumannii mang gen
NDM-1 kháng carbapenem tại ba bệnh viện.
Các bệnh viện cần mở rộng hợp tác nghiên cứu để nghiên cứu sâu hơn về các đặc điểm lâm sàng, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen NDM-1.
Tài Liệu Tham Khảo
Tiếng Việt
1. GARP-Việt Nam (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh và kháng
kháng sinh ở Việt Nam, Global Antibiotic Resistance Partnership (GARP)-
Vietnam, Hà Nội, Việt Nam.
2. Nguyễn Thị Thanh Hà (2015), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và vi sinh ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do Acinetobacter baumannii, Luận án tiến sĩ y
học, Viện Nghiên cứu Khoa học Y dược học Lầm sàng 108, Hà Nội.
3. Trần Huy Hoàng (2014), Một số đặc điểm dịch tễ học của nhiễm khuẩn bệnh
viện do vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức-Hà Nội, 2010-2011, Luận án tiến sĩ y tế công cộng, Viện Vệ sinh Dịch