2.6. Các phương pháp nghiên cứu
2.6.2.3. Phân tích mối liên hệ kiểu gen các chủng A baumannii bằng kỹ thuật
thuật PFGE [39]
Tách DNA vi khuẩn trong đệm thạch:
- Lấy một khuẩn lạc của các chủng A. baumannii và chủng vi khuẩn
Braenderup H9812 (chủng chuẩn) trên đĩa thạch Mueller-hinton được nuôi
cấy qua đêm ở 37oC cấy vào ống canh thang LB, ủ ở 37oC qua đêm
- Hút canh khuẩn vào tube ly tâm 1.5ml, ly tâm 8000vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ nước nổi, rửa cặn bằng TE 1X sau đó ly tâm 8000vịng/phút trong 5 phút. Giữ lại cặn và hồn ngun vào 500 µl CSB, bổ sung protein K (20mg/ml) và đảo nhẹ bằng pipet.
- Bổ sung SGA-SDS 1% vào hỗn dịch vi khuẩn, trộn đều, sau đó nhỏ hỗn dịch vào khn tạo plug, để ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút cho đông.
- ly giải tế bào vi khuẩn bằng dung dịch CLB (1mg/ml protein K, 1% N- lauroylsarcosin trong 0.5M EDTA pH 8.0), bổ sung 30µl proiein K (20mg/ml) lắc nhẹ trong bể ủ nhiệt ở 55o C qua đêm.
Rửa plug sau khi ly giải:
- Loại bỏ nước ly giải tế bào, rửa plug bằng nước khử ion vô trùng 2 lần mỗi lẫn 15 phút ở 55oC. Thực hiện bước rửa tương tự bằng TE 1 X sau đó giữ plug trong TE 1X ở 4oC tới khi sử dụng.
Cắt DNA vi khuẩn bằng enzyme cắt giới hạn:
- Cắt chromosomal DNA của vi khuẩn đã tách chiết trong thạch bằng Enzym giới hạn XbaI (đối với chủng chuẩn Braenderup H9812 ) và ApaI (cho A.
baumannii) nồng độ 30UI/ miếng thạch ở 370C trong vòng 12-16 giờ.
- Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1%, ở hiệu điện thế 6V/cm trong 19 giờ ở nhiệt độ 140C, thời gian một xung từ 25 đến 60s và góc điện trường là 120 độ.