2.6. Các phương pháp nghiên cứu
2.6.2.2. Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử bằng kỹ thuật multilocus
sequence typing (MLST)
Phương pháp của Bartual và cộng sự sẽ được áp dụng để tiến hành kỹ thuật MLST. Trong kỹ thuật MLST, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sau đó tiến hành
giải trình tự. Số lượng Allele sẽ phân loại các ST (sequence type) sau khi số liệu này được gửi vào dedicated data- base (http://pubmlst.org). Các dữ liệu về Allele của 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sẽ được phân
tích trên cơ sở dữ liệu về MLST của Acinetobacter baumannii
http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_abaumannii_oxford_seqdef
Bảng 2.2. Các trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật MLST đối với chủng A.
baumannii [11] TT Tên Trình tự mồi Kích thƣớc (bp) Tài liệu tham khảo 1
gltA -F AAT TTA CAG TGG CAC ATT AGG TCC C
772
A. baumannii
MLST website gltA -R GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA
CAC G
2
gyrB -F TGA AGG CGG CTT ATC TGA GT
594 gyrB -R GCT GGG TCT TTT TCC TGA CA
3
gdhB -F GCT ACT TTT ATG CAA CAG AGC C
774 gdhB -R GTT GAG TTG GCG TAT GTT GTG C
4
recA -F CCT GAA TCT TCY GGT AAA AC
425 recA -R GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC
5
cpn60-F GGT GCT CAA CTT GTT CGT GA
640 cpn60-R CAC CGA AAC CAG GAG CTT TA
6
gpi-F GAA ATT TCC GGA GCT CAC AA
456 gpi-R TCA GGA GCA ATA CCC CAC TC
7
rpoD -F ACC CGT GAA GGT GAA ATC AG
672 rpoD -R TTC AGC TGG AGC TTT AGC AAT
Sau khi chạy PCR với 7 cặp mồi cho kỹ thuật MLST, sản phẩm PCR sẽ được mang đi tinh sạch bằng bộ kit DNA Gel purification (QIAGEN).Thực hiện phản ứng Bigdye – PCR
- Tinh sạch sản phẩm DNA: Cho 45 µl Sam solution và 10 µl X-termination/ mẫu bệnh phẩm. Lắc 2000 vòng/30 phút, ly tâm 3000 vòng trong 2-3 phút lấy nước nổi cho vào máy giải trình tự gen.
- Đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied Biosystem, Mỹ). - Phân tích trình tự gen: So sánh các đoạn gen với các trình tự chuẩn của ngân hàng gen trên website của đơn vị nghiên cứu Oxford http://pubmlst.org