1 – Nguồn sáng 2 – Gương cố định 3 – Gương di động 4 – Bộ phân chia chùm sáng 5 – Mẫu 6 – Detector 7 – Computer 8 – Bút tự ghi
Bột HA đƣợc phân tích FTIR để xác định sự có mặt của các nhóm chức: OH-, CO32-, HPO42-, 3
4
PO . Bƣớc sóng đặc trƣng cho các nhóm chức có thể có mặt trong bột HA đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng1. 1: Bước sóng đặc trưng của các nhóm chức
Nhóm chức Bƣớc sóng (cm-1) H – O Str C – O Str P – O Str (H3PO4) CO32- Str P – O Str P – O Str H – O Bend O – P – O Bend 3445 2345 1649 1545 – 1445 1091 962 632 576
1.5.3. Phƣơng pháp hiển vi điện tử
1.5.3.1. Phương pháp hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy, SEM)
Nguyên tắc của phƣơng pháp hiển vi điện tử quét là dùng chùm điện tử quét lên bề mặt mẫu và thu nhận lại chùm tia phản xạ. Qua việc xử lý chùm tia phản xạ này, có thể thu đƣợc những thơng tin về hình ảnh bề mặt mẫu để tạo ảnh của mẫu nghiên cứu.
Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử quét cho phép quan sát mẫu với độ phóng đại rất lớn, từ hàng nghìn đến hàng chục nghìn lần.
Chùm điện tử đƣợc tạo ra từ catot qua hai tụ quang sẽ đƣợc hội tụ lên mẫu nghiên cứu. Chùm điện tử đập vào mẫu phát ra các điện tử phản xạ thứ cấp. Mỗi điện tử phát xạ này qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành tín hiệu sáng, chúng đƣợc khuếch đại đƣa vào mạng lƣới điều khiển tạo độ sáng trên màn hình.
Mỗi điểm trên mẫu nghiên cứu cho một điểm trên màn hình. Độ sáng tối trên màn hình phụ thuộc lƣợng điện tử thứ cấp phát ra tới bộ thu, đồng thời còn phụ thuộc bề mặt của mẫu nghiên cứu. Ƣu điểm của phƣơng pháp SEM là có thể thu đƣợc những bức ảnh ba chiều rõ nét và khơng địi hỏi khâu chuẩn bị mẫu q phức tạp. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho độ phóng đại nhỏ hơn phƣơng pháp TEM.
Hình 1.23: Sơ đồ nguyên lí SEM
1.5.3.2. Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microcopy, TEM) TEM)
Nguyên tắc của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) là sử dụng chùm điện tử xuyên qua mẫu cần nghiên cứu. Do vậy, các mẫu này cần phải đủ mỏng để chùm điện tử xuyên qua.
Hình 1.24: Nguyên tắc chung của phương pháp hiển vi điện tử
Chùm tia điện tử đƣợc tạo ra từ hai súng phóng điện tử sẽ đƣợc hội tụ lên mẫu nghiên cứu. Khi chùm tia điện tử đập vào mẫu sẽ phát ra các chùm tia điện tử phản xạ và điện tử truyền qua. Chùm tia điện tử truyền qua này đƣợc đi qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành một tín hiệu ánh sáng, tín hiệu này đƣợc khuếch đại, đƣa vào mạng lƣới điều khiển để tạo ra độ sáng trên màn ảnh. Mỗi điểm trên mẫu cho một điểm tƣơng ứng trên màn ảnh, độ sáng tối phụ thuộc vào lƣợng điện tử phát ra tới bộ thu.
Cơ chế phóng đại của TEM là nhờ thấu kính điện tử đặt bên trong hệ đo. Thấu kính này có khả năng thay đổi tiêu cự. Khi tia điện tử có bƣớc sóng cỡ 0,4nm chiếu lên mẫu ở hiệu điện thế khoảng 100 kV, ảnh thu đƣợc cho biết chi tiết hình thái học của mẫu theo độ tƣơng phản tán xạ và tƣơng phản nhiễu xạ, qua đó có thể xác định đƣợc kích thƣớc hạt một cách khá chính xác.
Sử dụng chùm tia điện tử để tạo ảnh mẫu nghiên cứu, ảnh đó khi đến màn hình huỳnh quang có thể đạt độ phóng đại theo yêu cầu. Chùm tia điện tử đƣợc tạo ra từ catot qua hai “tụ quang” điện tử sẽ đƣợc hội tụ lên mẫu nghiên cứu. Khi chùm tia điện tử đập vào mẫu sẽ phát ra các chùm tia điện tử phản xạ và điện tử truyền qua. Các điện tử phản xạ và điện tử truyền qua này đƣợc đi qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành một tín hiệu ánh sáng, tín hiệu này đƣợc khuếch đại, đƣa vào mạng lƣới điều khiển để tạo ra độ sáng trên màn.
1.5.4. Phƣơng pháp phân tích nhiệt trọng lƣợng
Phân tích nhiệt trọng lƣợng là phép đo sự thay đổi khối lƣợng của mẫu đo khi tác động nhiệt độ theo một chƣơng trình nhất định lên mẫu.
1.5.4.1. Phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DTA)
Từ giản đồ phân tích nhiệt DTA của mẫu có thể nhận biết các biến đổi liên quan đến hiệu ứng nhiệt, phản ứng hoá học (phản ứng cháy hay phân huỷ,…), q trình chuyển pha (nóng chảy, kết tinh hay chuyển pha thù hình)… Có thể xác định đƣợc
1.5.4.2. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)
Về nguyên lý, thiết bị đo TGA thực chất là một chiếc cân mà phần quang cân chứa mẫu đo đƣợc đặt trong lò nhiệt. TGA cho phép nhận biết sự phụ thuộc đồng thời của khối lƣợng mẫu vào nhiệt độ: m = fTGA(T).
Phép đo TGA đƣợc ứng dụng rất nhiều trong hóa học để nghiên cứu các q trình có sự biến đổi khối lƣợng theo nhiệt độ: độ bền nhiệt của các chất, cơ chế của sự phân hủy nhiệt, nhất là các polyme, các quá trình gia tăng khối lƣợng, quá trình mất nƣớc ẩm (nƣớc tự do, nƣớc kết tinh)… Ngoài ra, kết hợp với các phƣơng pháp khác, phép đo TGA cịn có thể góp phần xác định các thơng số nhiệt động học và một số hiệu ứng vật lý của các vật liệu.
Khảo sát tính chất nhiệt của mẫu HA bằng phƣơng pháp TGA đƣợc thực hiện trên thiết bị phân tích Shimadzu TGA – 50 H (Nhật Bản) tại Viện Hóa Học (Viện KH & CN Việt Nam). Mẫu HA đƣợc đo trong khơng khí, tốc độ qt nhiệt 100C/phút. Từ giản đồ phân tích nhiệt, có thể nhận biết hàm lƣợng ẩm trong nguyên liệu ban đầu và trong mẫu HA, xác định đƣợc hàm lƣợng CaCO3 nếu có, nhiệt độ phân hủy của HA.
1.5.5. Tách HA từ xƣơng động vật băng phƣơng pháp đông khô [19]
Đông khô là phƣơng pháp bảo quản, lƣu trữ nông sản, thực phẩm, tinh dịch, vacxin… bằng cách làm đông nhanh ở nhiệt độ - 800C cho bốc hết hơi nƣớc và giữ trong bình gắn kín. Khi dùng chỉ cần thêm nƣớc vừa đủ để tái tạo chế phẩm tƣơi.
1.5.5.1. Cơ sở lý luận
Nông sản, thực phẩm trong quá trình bảo quản thƣờng bị thối hỏng là do nhiều ngun nhân, trong đó có 2 ngun nhân chính là hoạt động xâm nhiễm của vi sinh vật và hoạt động chuyển hóa sinh, lý hóa sinh trong tế bào của chính nơng sản, thực phẩm.
Vi sinh vật và nấm men cần có một lƣợng nƣớc nhất định mới hoạt động đƣợc. Theo kết quả nghiên cứu, vi khuẩn cần 18 % nƣớc, nấm men 20 %, nấm mốc 13 - 16 % nƣớc.
Tuyệt đại da số nông sản, thực phẩm đều có chứa một lƣợng nƣớc nhất định (nƣớc tự do và nƣớc liên kết), nó thay đổi tùy theo hình thái giải phẫu và trạng thái keo ƣa nƣớc trong tế bào sản phẩm. Để bảo quản tốt nông sản, thực phẩm ta cần hạ thấp độ ẩm xuống mức an tồn vì khi độ ẩm sản phẩm tăng lên thì cƣờng độ hơ hấp của sản phẩm tăng lên, nếu vƣợt mức cân bằng giới hạn thì cƣờng độ hơ hấp tăng rất nhanh ảnh hƣởng rất xấu cho quá trình bảo quản.
Trong điều kiện đông khô, vi sinh vật bị ức chế hoặc tiêu diệt, tế bào bị mất nƣớc ở mức độ ẩm giới hạn an toàn. Lúc này trạng thái sinh lý của tế bào ở trạng thái nghỉ (khơng hoạt động) vì vậy tế bào đã đƣợc xử lý sấy thăng hoa có thời gian bảo quản lâu.
1.5.5.2. Công nghệ đông khô
Đông khô là quá trình mà nƣớc đƣợc lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Trƣớc khi làm thoát nƣớc ở thực phẩm ra, ngƣời ta làm cho nƣớc ở thực phẩm đơng lại, sau đó dùng chân không để nƣớc thăng hoa và bốc hơi đi. Cơng nghệ này địi hỏi phải có trang thiết bị là máy đơng khơ và tùy thuộc vào loại thực phẩm hoặc vi sinh vật cần bảo quản. Sau khi thực phẩm khơ phải làm lạnh ngay và bao gói kín trong chân khơng hoặc có khí trơ để tránh khơng khí thấm qua làm ẩm ƣớt trở lại. Kho phải mát khô ráo, ẩm độ 70%.
Phƣơng pháp đông khô chủ yếu dùng trong bảo quản nông sản, thực phẩm tuy nhiên phƣơng pháp này cũng đƣợc dùng để bảo quản vi sinh vật [13].
1.6. Xác định độ xốp tổng của các mẫu HA theo trọng lƣợng riêng
Trọng lƣợng riêng biểu kiến (ρbk): là trọng lƣợng của 1 đơn vị thể tích hình học của vật thể, đƣợc xác định bằng phƣơng pháp hình học: ρbk = m/Vt (g/cm3).
Trong đó, m là trọng lƣợng và Vt là thể tích mẫu bao gồm cả phần rắn lẫn phần rỗng (cm3).
Vt = V + Vr, trong đó V là phần thể tích rắn, Vr là phần thể tích rỗng (cm3). Trọng lƣợng riêng lý thuyết (ρlt), ρlt = m/V. Trọng lƣợng riêng lý thuyết của HA: ρlt = 3,156 g/cm3 .
Trọng lƣợng riêng thật (ρt): ρt = M1.ρH/(M1 - M2), M1 và M2 là trọng lƣợng của mẫu đƣợc cân trong khơng khí và nƣớc (g), ρH là trọng lƣợg riêng của nƣớc (g/cm3). Độ xốp tổng: Pt = Vr/Vt = (Vt - V)/Vt = 1 - V/Vt = 1 - ρbk /ρlt (%). (30)
1.7. Vai trò của xƣơng trong cơ thể ngƣời và động vật
Xƣơng là phần quan trọng của cơ thể ngƣời, có ý nghĩa to lớn về mặt sinh học và cấu trúc. Về mặt sinh học, xƣơng là nơi tập trung canxi nhiều nhất và là nơi sản xuất các tế bào máu. Còn về mặt cấu trúc, xƣơng là khung đỡ cho các bộ phận khác, hình thành nên kiến trúc và hình dáng cơ thể. Chất khống trong xƣơng gồm chủ yếu là HA dạng khối xốp và một số chất chứa Na+, K+, Mg2+, Cl-, F-, CO32- [6,7].
Hình 1.25: Cấu tạo của xương
Khi mới sinh ra, xƣơng có tỷ lệ collagen nhiều và tỷ lệ khống ít. Càng lớn lên, tỷ lệ khống càng tăng lên, xƣơng càng trở nên giịn, dễ gãy. Trong xƣơng ngƣời trẻ tuổi thì các pha vơ định hình chiếm ƣu thế và chỉ có một phần chuyển hố thành pha tinh thể, cịn ở ngƣời trƣởng thành thì đến 70% khối lƣợng của xƣơng là HA. HA có vi cấu trúc là các sợi tinh thể dài khoảng 10 15 nm kết thành bó xốp với độ xốp từ 40
60% gồm các mao quản thông nhau tạo ra phần khung của xƣơng [8]. Do có hoạt tính sinh học, có khả năng tƣơng thích với các cấu trúc xƣơng và có tính dẫn xƣơng tốt nên HA có thể đƣợc dùng để nối ghép, thay thế xƣơng trong cơ thể ngƣời. Các phẫu thuật ghép xƣơng, chỉnh hình đã đạt đƣợc nhiều thành tựu nhờ ứng dụng vật liệu y sinh HA.
Một vấn đề lớn khác đối với y học thế giới đó là căn bệnh lỗng xƣơng. Mặc dù khơng gây tử vong nhƣng bệnh loãng xƣơng ảnh hƣởng rất nhiều đến chất lƣợng cuộc sống của số đông ngƣời cao tuổi, đặc biệt là phụ nữ. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 1/3 phụ nữ và 1/5 nam giới trên 50 tuổi bị bệnh loãng xƣơng. Dự báo tới năm 2050, tồn thế giới sẽ có tới 6,3 triệu trƣờng hợp gãy cổ xƣơng đùi do loãng xƣơng và 51% số này sẽ ở các nƣớc châu Á, nơi mà khẩu phần ăn hàng ngày cịn rất thiếu canxi và việc chẩn đốn sớm và điều trị tích cực bệnh lỗng xƣơng cịn gặp rất nhiều khó khăn. Ở Mỹ, ngành y tế đã phải tiêu tốn hàng năm khoảng 14 tỉ USD để điều trị cho 1,5 triệu trƣờng hợp gãy xƣơng do bệnh loãng xƣơng gây ra [9]. 1.8. Khái quát về chất phụ gia thực phẩm
1.8.1. Định nghĩa
Theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lƣơng Liên Hiệp Quốc (FAO), phụ gia thực phẩm là chất không dinh dƣỡng đƣợc thêm vào các sản phẩm với các ý định khác nhau. Thơng thƣờng, các chất này có hàm lƣợng thấp dùng để cải thiện tính chất cảm quan, cấu trúc, mùi vị cũng nhƣ bảo quản sản phẩm.
Cịn theo định nghĩa của Viện Thơng tin Y học Trung ƣơng, phụ gia thực phẩm là một chất có hay khơng có giá trị dinh dƣỡng, khơng đƣợc tiêu thụ thơng thƣờng nhƣ một thực phẩm. Nó là một chất chủ ý bổ sung vào thực phẩm để giải quyết mục đích cơng nghệ trong sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nhằm cải thiện kết cấu hoặc đặc tính kĩ thuật của thực phẩm đó.
1.8.2. Tầm quan trọng của việc sử dụng phụ gia trong thực phẩm
Phụ gia góp phần điều hòa nguồn nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất thực phẩm, tạo đƣợc nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của ngƣời tiêu dùng. Giữ đƣợc chất lƣợng toàn vẹn của thực phẩm cho tới khi sử dụng, kéo dài thời gian sử dụng ủa thực phẩm. Tạo sự dễ dàng trong sản xuất, chế biến thực phẩm va làm tăng giá trị thƣơng phẩm trên thị trƣờng đồng thời làm giảm phế liệu trong các công đoạn sản xuất.
Những nguy hại của phụ gia thực phẩm: Sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lƣợng, chủng loại nhất là phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây hại cho sức khỏe nhƣ gây ngộ độc cấp tính, nếu dùng quá liều cho phép sẽ gây ngộ độc mạn tính, dù dùng liều lƣợng nhỏ, thƣờng xuyên, liên tục một chất phụ gia thực phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thƣơng lâu dài.
1.8.3. Quy định về sử dụng phụ gia thực phẩm
Các chất phụ gia thực phẩm chỉ đƣợc phép sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh tại thị trƣờng Việt Nam phải có tên trong danh mục các chất phụ gia đƣợc phép sử dụng và phải đƣợc chứng nhận phù hợp tiêu chuẩn chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm bởi cơ quan có thẩm quyền. Việc sử dụng phụ gia thực phẩm trong danh mục sản xuất chế biến, xử lý, bảo quản, bao gói và vận chuyển thực phẩm phải đƣợc thể hiện theo “Quy định về chất lƣợng an toàn thực phẩm của Bộ Y tế”. Việc sử dụng phụ gia thực phẩm trong danh mục phải đảm bảo đúng đối tƣợng thực phẩm và liều lƣợng khơng vƣợt q giới hạn an tồn cho phép; đáp ứng yêu cầu kĩ thuật, vệ sinh an toàn quy định cho mỗi chất phụ gia; không làm biến đổi bản chất, thuộc tính tự nhiên của thực phẩm; các chất
phụ gia thực phẩm trong danh mục lƣu thơng trên thị trƣờng phải có nhãn với đầy đủ các nội dung theo quy định.
1.8.4. Phụ gia natri bicacbonat [15]
Natri hiđrocacbonat hay natri bicacbonat là tên gọi phổ biến trong hóa học, cịn tên thƣờng gọi bình dân là bột nở, bột nổi, thuốc sủi ... có cơng thức hóa học là NaHCO3. Thƣờng ở dạng bột mịn, màu trắng, dễ hút ẩm, tan nhanh trong nƣớc, có đặc
tính khơng mùi, khơng vị, khi có sự hiện diện của ion H+ khí CO2 sẽ phát sinh và thốt ra. NaHCO3 là phụ gia phổ biến, khơng có tính độc và nằm trong danh mục các chất phụ gia đƣợc phép sử dụng trong các ngành cơng nghiệp hóa chất, thực phẩm, dƣợc phẩm.
Natri bicacbonat có mã hiệu thực phẩm theo tiêu chuẩn quốc tế với INS: 500ii (Sodium Hydrogen Carbonate). Muối này có tác dụng giúp thực phẩm nhanh nhừ, tiết kiệm thời gian và năng lƣợng trong quá trình tiến hành, điều chỉnh độ axit, tạo xốp, cải thiện tính chất bột và tạo nở, chống đơng vón…
Dung dịch NaHCO3 tạo ra môi trƣờng kiềm, dƣới tác dụng của nhiệt độ NaHCO3 phân hủy nhanh tạo ra Na2CO3 có mơi trƣờng kiềm mạnh hơn, sẽ giúp thủy phân các protein thành các axit amin; chất béo thủy phân thành glixerol và muối của các axit hữu cơ nhanh hơn.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất 2.1.1. Dụng cụ 2.1.1. Dụng cụ
- Cốc thủy tinh 100 ml, 200 ml, 400 ml, 500 ml… - Chén nung, cốc cân, ống nghiệm
- Bình cầu, mắt kính thủy tinh - Nhiệt kế thủy ngân
- Cối sứ, cối mã não
- Đũa thủy tinh, thìa, kẹp sắt - Khay sắt, dao, kéo, cƣa sắt, cát - Thƣớc kẹp kĩ thuật
2.1. 2. Thiết bị
- Tủ sấy, bếp điện
- Nồi áp suất nhơm Sunhouse 3,0 lít PA 300, nhiệt độ tối đa là 1200C, áp suất là 1,7 atm
- Cân điện tử có độ chính xác ± 10-4 g