Đột
biến/Mồi Trình tự mồi Chế độ nhiệt
Sản phẩm
PCR
A3243G
Fw: 5’ CAA GAG AAA TAA GGC TTA CTT C 3’ (3134-3155)
Rv: 5’GGA GTA GGA GGT TAG CCA TGG G 3’ (3310-3331) 94o C: 30 giây 56 o C: 30 giây 72 o C: 30 giây 198 bp A8344G
Fw: 5’GGT ATA CTA CGG TCA ATG CTC 3’ (8155-8175).
Rv: 5’ TTT CAC TGT AAA GAG GTGTGG G 3’ (8366-8345) 94 o C: 30 giây 58 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút 212 bp G11778A
Fw 5’ CTT CAC CGG CGC AGT CAT TC 3’ (11683- 11702)
Rv 5’ GTT GTG GTA AAT ATG TAG AG 3’ (12000- 11981)
94 o C: 1 phút 56 o C: 1 phút
72 o C: 1 phút 318 bp
T8993G/C
Fw: 5’ CAA CTA ACC TCC TCG GAC 3’(8768-8785)
Rv: 5’ TGA AAA CGT AGG CTT GGA T 3’ (9169-9151)
94 o C: 10 giây 55 o C: 40 giây
72 o C: 1 phút 402 bp
G3380A
Fw: 5’-GGC ATT CCT AAT GCT TAC CGA TC-3(3357-3379) Rv: 5’-AGA TGT GGC GGG TTT TAG GG-3(3504-3485) 94 o C: 10 giây 55 o C: 40 giây 72 o C: 1 phút 148 bp
2.2.4. Điện di trên gel agarose và gel polyacylamide
Gel agarose 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. 5µl mẫu DNA đƣợc trộn đều với 1µl dung dịch đệm tra mẫu, tra lên giếng gel đã chuẩn bị trong đệm TAE 1X. Thang chuẩn DNA 100 bp đƣợc điện di song song cùng với mẫu. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu cách mép bản gel khoảng 2 cm (kích thƣớc bản gel dài x rộng là 6 x 5 cm). Bản gel chứa các băng DNA đƣợc ngâm trong Ethidium bromide ở nồng độ 50 µg/ml khoảng 5-10 phút và quan sát trên máy soi và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad).
Gel polyacrylamide 12% đƣợc trộn với các thành phần nhƣ sau: Dung dịch acrylamide 30% 2 ml, TBE 5X 1ml. APS 10% 35 µl, TEMED 3,5 µl và nƣớc cất khử trùng 2 ml. Hỗn hợp sau đó đƣợc đổ vào khay và lƣợc đã đã đƣợc lắp đặt sẵn. Sau 30 phút có thể sử dụng gel cho điện di.
Mẫu DNA đƣợc trộn với đệm mẫu và tra vào đƣờng chạy điện di trong đệm TAE 1X với hiệu điện thế ổn định 120volt cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 0,5 cm (kích thƣớc bản gel dài x rộng là 10 x 7 cm) thì dừng lại. Gel đƣợc nhuộm bằng EtBr nồng độ 50 µg/ml, sau khoảng 5-10 phút, bản gel đƣợc lấy ra, rửa dƣới vòi nƣớc và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel (Biorad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.5. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA)
Trong thí nghiệm này, mẫu dị huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dị có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) HEX (535/556 nm) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự khơng đột biến và FAM (495/520 nm) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự đột biến, cịn đầu 3’ của mẫu dị có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher). Ngoài ra, để tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dị, trong trình tự của mẫu dị cịn có nucleotide cải biến dạng khóa bằng cầu methyl (locked nucleic acid). Trình tự các mồi và mẫu dị huỳnh quang cho real-time PCR trình bày ở bảng 2.2.
Nguyên tắc của phƣơng pháp: Khi chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dị Taqman vẫn còn nguyên vẹn nên huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ, ống phản ứng sẽ không phát đƣợc huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có kéo dài mồi thì Taq DNA polymerase (nhờ có hoạt tính 5’-exonuclease) (do có hoạt tính 5’-exonuclease) tách reporter khỏi quencher, và sẽ phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lƣợng reporter tự do
càng nhiều và cƣờng độ huỳnh quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang.
Trong nghiên cứu này, các phản ứng real-time sử dụng mẫu dị huỳnh quang chứa tín hiệu HEX cho DNA khn khơng mang đột biến và mẫu dị chứa tín hiệu huỳnh quang FAM cho DNA khn mang đột biến. Do đó, khi kết thúc phản ứng real- time PCR, nếu chỉ thu đƣợc tín hiệu HEX chứng tỏ mẫu DNA khuôn không mang đột biến. Ngƣợc lại, nếu chỉ thu đƣợc tín hiệu FAM chứng tỏ DNA khuôn mang đột biến ở dạng đồng nhất và nếu thu đƣợc cả hai loại tín hiệu FAM và HEX thì chứng tỏ mẫu DNA khn mang đột biến ở dạng không đồng nhất.
Tiến hành phản ứng với đồng thời 4 mẫu chuẩn là các đối chứng dƣơng để dựng đƣờng chuẩn nhằm định lƣợng số bản sao của mẫu bệnh phẩm; đối chứng âm để kiểm tra dƣơng tính giả.
Thành phần phản ứng bao gồm 15 µl master mix (Taq DNA polymerase (5 đơn vị), dNTP, MgCl2, UNG (5 đơn vị), 10 pmol mồi xi, 10 pmol mồi ngƣợc, 2 pmol mẫu dị đột biến và 2 pmol mẫu dị khơng đột biến của từng đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C), DNA khuôn (15-25 ng), bổ sung nƣớc hoặc đệm TE 1X cho đến thể tích cuối cùng là 20 µl. Hỗn hợp đƣợc đặt vào máy real-time PCR. Lựa chọn các kênh màu huỳnh quang FAM và HEX, khai báo số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn và cài đặt với chu trình nhiệt: 50oC trong 4 phút cho hoạt hóa UNG, 95oC trong 10 phút cho biến tính ban đầu, 40 chu kì bao gồm 95oC trong 15 giây cho biến tính, 60oC trong 30 giây cho gắn mồi và kéo dài chuỗi.
Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, dựa trên số lƣợng bản sao đã biết của mẫu chuẩn mà máy tính ra số lƣợng bản sao đột biến và khơng đột biến của mẫu cần phân tích đồng thời cũng đƣa ra các thông số khác bao gồm hiệu suất PCR, hệ số tƣơng quan tuyến tính giữa chu kì ngƣỡng và số bản sao ban đầu.
Dựa trên kết quả số bản sao đột biến và khơng đột biến của mẫu cần phân tích hiển thị trên máy tính, tỷ lệ đột biến của mẫu bệnh phẩm đƣợc tính theo cơng thức:
Số bản sao đột biến (FAM) % Đột biến =
Số bản sao đột biến (FAM) + Số bản sao không đột biến (HEX)
2.2.6. Phương pháp thống kê.
Các mẫu đƣợc đo 3 lần và xử lí bằng phƣơng pháp thống kê, sử dụng hàm AVERAGE cho tính giá trị trung bình và tính sai số bằng cách sử dụng hàm tính độ lệch chuẩn STDEV trong Excel.