1.2.1 .Đột biến gen ty thể
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến gen ty thể
Các đặc điểm hóa sinh, di truyền và các tác động lâm sàng của sự rối loạn mtDNA là cực kỳ phức tạp bao gồm các đặc điểm chung: rối loạn vận động, co giật, tâm thần phân liệt, sa mi mắt hay liệt cơ mắt, bệnh liên quan đến sắc tố thị giác, teo dây thần kinh thị giác và mù, điếc, bệnh cơ tim, mất chức năng của tụy và gan, tiểu đƣờng, chậm phát triển tinh thần vận động, thiếu máu, tăng acid lactic. Tuy nhiên, tác động về mặt lâm sàng, hình thái và hóa sinh học của bệnh do rối loạn ty thể thay đổi rất lớn. Vì vậy nếu chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng để chẩn đốn bệnh ty thể là
vơ cùng khó khăn. Hiện nay, phân tích DNA là những phƣơng pháp hiện đại nhất cho phép phát hiện nhanh và chính xác các đột biến gen gây bệnh. Ngồi ra, phân tích mtDNA là cần thiết cho các tƣ vấn di truyền về bệnh do đột biến gen ty thể.
1.3.1. PCR-RFLP
Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA đƣợc phân cắt giới hạn. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự thay đổi về trình tự nucleotide của DNA do đột biến gen ty thể có thể dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm cắt của enzyme giới hạn, làm cho các đoạn DNA phân cắt có kích thƣớc khác nhau và đƣợc nhận biết dựa trên phổ băng khi điện di.
Cùng với sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction), kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn nhờ lƣợng DNA đích ban đầu đã đƣợc nhân bản lên một lƣợng đủ nhạy cho phân tích. Phối hợp giữa PCR và RFLP (PCR-RFLP) sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các đột biến di truyền trong đó có đột biến điểm mtDNA. Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc sau: (1) các đoạn mồi đƣợc thiết kế để khuếch đại đoạn mtDNA chứa vị trí đột biến; (2) sản phẩm PCR đƣợc phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn cắt đƣợc điện di trên gel agarose hay polyacrylamide khơng biến tính, nhuộm ethidium bromide và đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại.
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã sử dụng PCR-RFLP để sàng lọc các đột biến gen ty thể phổ biến với số lƣợng mẫu lớn nhƣ 1559 bệnh nhân ngƣời Trung Quốc đƣợc phân tích các đột biến A3243G, T8993G/C, A8344G, A1555G, G11778A, G3460A, T14484C [7]. 1725 bệnh nhân ngƣời Úc đƣợc sàng lọc đột biến A3243G, G13513A, T8993G/C, G3460A, G11778A, T14484C bằng PCR- RFLP [31]. Các đột biến A3243G, A8344G, T8993G, T8993C, A1555G, G11778A, A7445G, T3271G, T8356G đƣợc phân tích bằng PCR-RFLP trên 552 bệnh nhân ngƣời Trung Quốc [61], Gần đây hơn, 15 đột biến điểm ở 106 bệnh nhân nghi bệnh ty thể ngƣời Việt Nam cũng đƣợc phân tích bằng PCR-RFLP [53].
Có thể thấy đƣợc, trong phịng thí nghiệm lâm sàng, các đột biến mtDNA thƣờng đƣợc phát hiện bằng PCR-RFLP, là phƣơng pháp phổ biến nhất, đơn giản và hiê ̣u qu ả để phát hiện mtDNA đột biến khi sàng lọc v ới số lƣơ ̣ng mẫu lớn . Tuy nhiên, phƣơng pháp này có độ nhạy tƣơng đối, đơi khi đột biến khó đƣợc phát hiện vì tỷ lệ mtDNA đột biến trong mẫu nghiên cứu quá thấp. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP nhuộm ethidium bromide (EtBr) là 5-10% [5].