A: Đột biến A3243G, B: Đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến G11778A, E: Đột biến T8993G/C
Bảng 3.2. Thành phần cắt enzyme giới hạn Đột biến Đột biến Enzyme giới hạn (trình tự cắt) Đệm dùng cho enzyme Sản phẩm cắt DNA đột biến DNA không đột biến A3243G HaeIII (GG/CC) R 111 bp và 87 bp 198 bp A8344G BanII (GRGCY/C) Tango 99 bp, 41 bp, 52 bp và 20 bp 99 bp, 41 bp và 72 bp G11778A SfaNI (GCATC(N)5/) Tango 318 bp 213 bp và 105 bp T8993G/C HpaII (C/CGG) Tango 224 bp và 178 bp 402 bp G3380A Taq I (T/CGA) Tango 148 bp 126 bp và 22 bp
Hình 3.3. Điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn kiểm tra các đoạn gen đích
1: Thang chuẩn DNA, 2: Plasmid không mang đột biến, 3-4: Plasmid mang đột biến, A: Đột biến A3243G, B: Đột biến G3380A, C: đột biến A8344G, D: Đột biến G11778A,
E: Đột biến T8993G/C.
3.2. Tạo hỗn hơ ̣p phản ƣ́ng master mix cho real-time PCR
3.2.1. Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR
Các thành phần của master mix cho phản ƣ́ng real -time PCR bao gồm đê ̣m, Taq polymerase, các dNTP, MgCl2, mồi nhân bản, mẫu dò hoặc chất phát huỳnh quang và chất bảo quản hoặc làm bền. Trong đó mỗi thành phần đều có ảnh hƣởng nhất định đến kết quả phản ứng real-time PCR. Phối hợp các thành phần này một cách hợp lí sẽ tạo ra đƣợc master mix có khả năng phát hiện và định lƣợng đột biến gen ty thể.
Trong nghiên cứu này chúng tơi đã sử dụng hỗn hợp sẵn có Taq polymerase (5 đơn vị), đệm, dNTPs, MgCl2 sau đó bổ sung 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngƣợc, 1 pmol mẫu dò đột biến và 1 pmol mẫu dị khơng đột biến của từng đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A, bổ sung TE 1X cho thể tích cuối cùng là 15 µl. Hỗn hợp mới tạo thành đƣợc gọi là master mix cho real- time PCR để phát hiện và định lƣợng đột biến gen ty thể quan tâm.
Sử dụng các master mix đã đƣợc tạo ra, chúng tôi thử nghiệm phát hiện và định lƣợng các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A bằng cách xây dựng đƣờng chuẩn thể hiện tƣơng quan tỷ lệ nghịch giữa chu kì ngƣỡng và logarit số bản sao gen ty thể chứa và không chứa đột biến.
3.2.2.1. Xây dựng đường chuẩn đột biến A3243G
Plasmid 3243A và 3243G cùng một nồng độ từ 103 copy/µl đến 106 copy/µl đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 và tiến hành phản ứng real-time PCR.
Kết quả cho thấy đã thu đƣợc tín hiệu đột biến (FAM) và không đột biến (HEX) do mẫu dò bị thủy giải bởi Taq polymerase khi có mặt của DNA khn đột biến và khơng đột biến (Hình 3.4A) chứng tỏ master mix có khả năng phát hiện đột biến A3243G. Hiệu suất PCR nằm trong khoảng 85-105%. Hệ số tƣơng quan tuyến tính của hai kênh FAM và HEX lần lƣợt bằng 0,992 và 0,987 (Bảng 3.3) chứng tỏ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập có độ tuyến tính cao với kênh FAM tuy nhiên chƣa tuyến tính với kênh HEX chƣa cao (< 0,99). Do đó cần tiếp tục tối ƣu hóa master mix để tăng độ tin cậy trong định lƣợng đột biến.
3.2.2.2. Xây dựng đường chuẩn đột biến G3380A
Plasmid 3380A và 3380G cùng một nồng độ từ 103 copy/µl đến 106 copy/µl đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 và tiến hành phản ứng real-time PCR.
Kết quả cho thấy, đã thu đƣợc tín hiệu đột biến (FAM) và khơng đột biến (HEX) do mẫu dò bị thủy giải bởi Taq polymerase khi có mặt của DNA khn đột biến và khơng đột biến (Hình 3.4B) chứng tỏ master mix có khả năng phát hiện đột biến G3380A. Hiệu suất PCR nằm trong khoảng 85-97 %. Hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 = 0,996 và 0,997. Cƣờng độ huỳnh quang hai kênh tƣơng đối đều nhau (Bảng 3.3) chứng tỏ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập có độ tuyến tính cao với cả hai kênh và có độ tin cậy cao trong việc định lƣợng đột biến G3380A.
3.2.2.3. Xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G
Plasmid 8344A và 8344G cùng một nồng độ từ 103 copy/µl đến 106 copy/µl đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 và tiến hành phản ứng real-time PCR.
Kết quả cho thấy, đã thu đƣợc tín hiệu đột biến (FAM) và khơng đột biến (HEX) do mẫu dị bị thủy giải bởi Taq polymerase khi có mặt của DNA khn đột biến và khơng đột biến (Hình 3.4C) chứng tỏ master mix có khả năng phát hiện đột biến A8344G. Hiệu suất PCR nằm trong khoảng 82-84 %. Hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 = 0,995 và 0,990 (bảng 3.3) chứng tỏ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập có độ
tuyến tính cao với kênh FAM. Tuy nhiên hiệu suất PCR còn thấp <90%. Vì vậy cần tiến hành tối ƣu hóa cho master mix tăng độ tin cậy trong việc định lƣợng đột biến A8344G.
3.2.2.4. Xây dựng đường chuẩn đột biến T8993G
Plasmid 8993T và 8993G cùng một nồng độ từ 103 copy/µl đến 106 copy/µl đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 và tiến hành phản ứng real-time PCR.
Kết quả cho thấy, đã thu đƣợc tín hiệu đột biến (FAM) và khơng đột biến (HEX) do mẫu dò bị thủy giải bởi Taq polymerase khi có mặt của DNA khn đột biến và khơng đột biến (Hình 3.4D) chứng tỏ master mix có khả năng phát hiện đột biến T8993G. Hiệu suất PCR nằm trong khoảng 90-98 %. Hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 = 0,996 và 0,999 (Bảng 3.3) chứng tỏ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập có độ tuyến tính cao với kênh FAM. Tuy nhiên cƣờng độ huỳnh quang của 2 kênh chƣa đều nhau. Vì vậy cần tiếp tục tiến hành tối ƣu hóa cho master mix của đột biến này tăng độ tin cậy trong việc định lƣợng đột biến T8993G
3.2.2.5. Xây dựng đường chuẩn đột biến G11778A
Plasmid 11778A và 11778G cùng một nồng độ từ 103 copy/µl đến 106 copy/µl đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 và tiến hành phản ứng real-time PCR.
Kết quả cho thấy, đã thu đƣợc tín hiệu đột biến (FAM) và khơng đột biến (HEX) do mẫu dò bị thủy giải bởi Taq polymerase khi có mặt của DNA khn đột biến và khơng đột biến (Hình 3.4E) chứng tỏ master mix có khả năng phát hiện đột biến G1178A. Hiệu suất PCR nằm trong khoảng 94-98 %. Hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 = 0,993 và 0,999 (Bảng 3.3) chứng tỏ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập có độ tuyến tính cao với cả hai kênh FAM, HEX. Vì vậy, master mix có độ tin cậy cao trong việc định lƣợng đột biến G11778A.
3.2.2.6. Xây dựng đường chuẩn đột biến T8993C
Plasmid 8993T và 8993C cùng một nồng độ từ 103 copy/µl đến 106 copy/µl đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 và tiến hành phản ứng real-time PCR.
Kết quả cho thấy, đã thu đƣợc tín hiệu đột biến (FAM) và khơng đột biến (HEX) do mẫu dị bị thủy giải bởi Taq polymerase khi có mặt của DNA khn đột
biến và khơng đột biến (Hình 3.4F) chứng tỏ master mix có khả năng phát hiện đột biến T8993C. Hiệu suất PCR nằm trong khoảng 83-94 %. Hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 đều = 0,999 (Bảng 3.3) chứng tỏ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập có độ tuyến tính cao với cả hai kênh FAM và HEX. Vì vậy, master mix có độ tin cậy cao trong việc định lƣợng đột biến T8993C
Hình 3.4. Biểu đồ tƣơng quan tuyến tính giữa chu kì ngƣỡng và số bản sao ban đầu của các đột biến
A: Đột biến A3243G, B: đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến G11778A, F: Đột biến T8993C
Đƣờng màu đỏ là đƣờng chuẩn của kênh đột biến, Đƣờng màu xanh lá là đƣờng chuẩn của kênh không đột biến.
Bảng 3.3. Hiệu suất PCR và giá trị tƣơng quan tuyến tính của đƣờng chuẩn các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A
Đột biến Tín hiệu FAM (Đột biến) Tín hiệu HEX (Khơng đột biến)
Hiệu suất PCR ( %) R2 Hiệu suất PCR (%) R2 A3243G 105 0,992 85 0,997 G3380A 87 0,997 87 0,996 A8344G 85 0,996 87 0,997 T8993G 98 0,999 90 0,996 G11778A 98 0,998 94 0,993 T8993C 83 0,999 94 0,999
3.2.2. Xác định thành phần thích hợp cho master mix
Các thành phần cơ bản của master mix cho phản ƣ́ng real-time PCR bao gồm đệm, Taq polymerase, dNTPs, MgCl2, H2O, mồi nhân bản, mẫu dò hoặc chất phát
huỳnh quang và chất bảo quản hoặc làm bền. Trong đó mỗi thành phần đều có ảnh hƣởng nhất định đến kết quả phản ứng real-time PCR. Việc xác định các thành phần thích hợp nhằm giải quyết những vấn đề chung nhƣ khuếch đại sản phẩm không đặc hiệu, khuếch đại không đồng đều hoặc khơng khuếch đại đƣợc một số trình tự đích khó nhân bản. Đặc biệt là việc cải tiến độ nhạy và độ đặc hiệu của thành phần phản ứng có tính chất quyết định trong sản xuất các bộ kit thƣơng mại sử dụng real-time PCR.
Sau nhiều lần thăm dị, chúng tơi đã xác định đƣợc đƣợc thành phần thích hợp cho các master mix nhƣ sau: Hỗn hợp 2X (sẵn có Taq polymerase, đệm, dNTP, dUTP, MgCl2, UNG) mua từ hãng Enzynomic, bổ sung 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngƣợc, 2 pmol mẫu dị đột biến, 2 pmol mẫu dị khơng đột biến, bổ sung đệm TE 1X cho đủ thể tích cuối cùng là 15µl. Master mix cho real-time PCR mới đƣợc tạo ra có thay đổi so với master mix ở mục 3.2.1 về nồng độ mẫu dò và bổ sung thêm dUTP (0,2mM) UNG (5 đơn vị) là các chất giúp chống hiện tƣợng dƣơng tính giả.
So với các nghiên cứu trƣớc đó về định lƣợng đột biến gen ty thể bằng real- time PCR, 6 master mix do chúng tơi tạo ra có ƣu điểm là phát hiện và định lƣợng 6 đột biến điểm A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, G11778A, T8993C trong cùng một điều kiện phản ứng (nồng độ mồi và mẫu dò, cách thức thiết kế 6 loại mẫu dị, chu trình nhiệt) giúp tiết kiệm về thời gian cũng nhƣ chi phí cho nghiên cứu 6 đột biến gen ty thể cùng một thời điểm, đồng thời các master mix tạo ra có khả năng chống hiện tƣợng dƣơng tính giả.
Sau đó, chúng tơi thử nghiệm các master mix đã đƣợc xác định điều kiện thích hợp bằng cách xây dựng đƣờng chuẩn nhƣ mục 3.2.1. Kết quả cho thấy, ở từng nồng độ số bản sao ban đầu (từ 5x103 đến 5x106) chúng tơi đã thu đƣợc cả tín hiệu HEX và tín hiệu FAM từ mẫu dị huỳnh quang cho gen đích đột biến và khơng
đột biến tƣơng ứng (Hình 3.5) chứng tỏ master mix tạo ra có khả năng phát hiện các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A. Hiệu suất PCR nằm trong khoảng 85- 110%. Hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 cả hai kênh đều lớn hơn 0,99 (Bảng 3.4) chứng tỏ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập có độ tuyến tính cao với cả hai kênh tín hiệu FAM và HEX và master mix sau khi đƣợc xác định điều kiện thích hợp có độ tin cậy cao trong việc định lƣợng các đột biến nêu trên.
Hình 3.5. Biểu đồ tƣơng quan tuyến tính giữa chu kì ngƣỡng và số bản sao ban đầu của các đột biến sau khi đƣợc xác định điều kiện thích hợp.
A: Đột biến A3243G, B: đột biến G3380A, C: Đột biến A8344G, D: Đột biến T8993G, E: Đột biến G11778A, F: Đột biến T8993C.
Đƣờng màu đỏ là đƣờng chuẩn của kênh đột biến, Đƣờng màu xanh lam là đƣờng chuẩn của kênh không đột biến.
Bảng 3.4. Hiệu suất real-time PCR và giá trị tƣơng quan tuyến tính của đƣờng chuẩn các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A sau
khi đƣợc xác định điều kiện thích hợp
Đột biến Tín hiệu FAM (Đột biến) Tín hiệu HEX ( Không đột biến)
Hiệu suất PCR % R2 Hiệu suất PCR % R2 A3243G 110 0,998 89 1,000 G3380A 91 0,996 110 0,991 A8344G 85 0,999 88 1,000 T8993G 96 0,993 100 0,997 G11778A 98 0.999 94 0.999 T8993C 94 0,994 98 0,996
3.2.3. Đánh giá độ đặc hiệu của master mix
Nhằm xác định độ đặc hiệu của master mix trong việc phát hiện các đột biến gen ty thể, chúng tôi dùng các loại khuôn khác nhau để thực hiện thí nghiệm này.
Đầu tiên để kiểm tra hiện tƣợng dƣơng tính giả, chúng tơi sử dụng DNA khuôn bao gồm 3 mẫu bệnh phẩm khơng mang bất kì đột biến nào trong số 6 đột biến cần khảo sát là A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C (đã đƣợc xác định trƣớc đó bằng PCR-RFLP và giải trình tự). Kết quả cho thấy tín hiệu nhân bản chỉ xuất hiện ở kênh HEX đặc hiệu cho mẫu không đột biến mà không xuất hiện tín hiệu nhân bản của kênh FAM đặc hiệu cho mẫu có đột biến (Hình 3.6 chỉ minh họa một bệnh nhân). Điều này chứng tỏ master mix tạo ra cho kết quả âm tính đối với các mẫu bệnh phẩm không mang gen đột biến. Việc thu đƣợc tín hiệu HEX cịn chứng tỏ việc tách chiết DNA và điều kiện phản ứng real-time PCR vẫn diễn ra bình thƣờng. Do đó, master mix chúng tơi tạo ra có độ đặc hiệu 100% với các mẫu bệnh phẩm âm tính.
Hình 3.6. Đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR các mẫu bệnh phẩm không mang các đột biến
Mẫu dò huỳnh quang mang HEX, đặc hiệu cho mẫu khơng đột biến, Mẫu dị huỳnh quang mang FAM, đặc hiệu cho mẫu đột biến.
Trƣớc đó, chúng tơi đã nhân bản thành cơng các mẫu chuẩn mang đoạn gen chứa và không chứa đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C nhƣ ở mục 3.2.1. Điều này chỉ ra rằng master mix cho real-time PCR tạo ra có khả năng phát hiện các đoạn gen mang đột biến quan tâm. Tuy nhiên, để khẳng định lại, chúng tơi sử dụng một mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với đột biến A3243G (xác định bằng giải trình tự) để kiểm tra độ đặc hiệu của master mix với mẫu dƣơng tính thật.
Ngồi ra, để kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của master mix trên các vùng gen khác nhau của ty thể, chúng tôi sử dụng 6 hỗn hợp các plasmid chứa các vùng gen khác nhau của ty thể tuy nhiên các vùng gen này không đặc hiệu với mẫu dị và mồi của master mix. Thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ sau:
Hỗn hợp plasmid 1 bao gồm các plasmid 3380G, 3380A, 8344A, 8344G, 11778A, 11778G, 8993T, 8993G, 8993C đƣợc sử dụng làm khuôn cho master mix A3243G.
Hỗn hợp plasmid 2 bao gồm các plasmid 3243A, 3243G, 8344A, 8344G, 11778A, 11778G, 8993T, 8993G, 8993C đƣợc sử dụng làm khuôn cho master mix G3380A.
Hỗn hợp plasmid 3 bao gồm các plasmid 3243A, 3243G,3380A, 3380GG, 11778A, 11778G, 8993T, 8993G, 8993C đƣợc sử dụng làm khuôn cho master mix A8344G.
Hỗn hợp plasmid 4 bao gồm các plasmid 3243A, 3243G, 3380A, 3380GG, 8344A, 83448G, 8993T, 8993G, 8993C đƣợc sử dụng làm khuôn cho master mix G11778A.
Hỗn hợp plasmid 5 bao gồm các plasmid 3243A, 3243G, 3380A, 3380GG, 8344A, 83448G đƣợc sử dụng làm khuôn cho master mix T8993G.
Hỗn hợp plasmid 6 bao gồm các plasmid 3243A, 3243G, 3380A, 3380GG, 8344A, 83448G đƣợc sử dụng làm khuôn cho master mix T8993C.
Kết quả cho thấy với khuôn là mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với đột biến A3243G, master mix A3243G cho cả 2 kênh tín hiệu đột biến (3243FAM) và không đột biến (3243HEX). Điều này là phù hợp với tính tốn lý thuyết ban đầu thu đƣợc cả 2 kênh tín hiệu đối với bệnh nhân mang đột biến ở dạng khơng đồng nhất (Hình 3.7) chứng tỏ master mix có độ đặc hiệu đối với các mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với đột biến.
Trong khi đó, sử dụng khn là hỗn hợp plasmid 1-6 cho lần lƣợt các master mix phát hiện A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C khơng thu đƣợc tín hiệu của cả hai kênh đột biến và khơng đột biến (Hình 3.7). Mặc dầu, các hỗn hợp DNA khn có mang các đoạn gen ty thể khác nhau nhƣng khơng mang đoạn DNA ty thể đích. Điều này chứng tỏ rằng các master mix khơng có khả năng bắt cặp nhầm giữa các đoạn gen ty thể khác nhau và do đó sẽ phát hiện chính xác đoạn gen chứa đột biến đích.
Trong tế bào ty thể tồn tại với rất nhiều bản sao, các đoạn gen đích trên các bản sao này đơi khi chỉ khác nhau một nucleotide, do đó các phƣơng pháp phát hiện đột biến gen ty thể địi hỏi phải có độ đặc hiệu rất cao gần nhƣ đạt tuyệt đối. Trong
hầu hết các nghiên cứu sử dụng real-time PCR phát hiện các đột biến A3243G, T8993G/C, G11778A đều có độ đặc hiệu lên tới 100% [43, 47, 56].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, master mix cho phép phát hiện các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C có độ đặc hiệu với các mẫu dƣơng tính và âm tính là 100% và khơng có khả năng bắt cặp nhầm giữa các