2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu máu ngoại vi của 52 bệnh nhân ngƣời Việt Nam nghi bị bệnh ty thể (có đơn tƣ̣ nguyê ̣n tham gia nghiên cƣ́u ) đƣợc lấy theo các quy chuẩn của Bệnh viện Nhi Trung ƣơng. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đƣợc nghi ngờ bệnh do rối loạn ty thể dựa trên sự có mặt tối thiểu hai trong ba đặc điểm sau:
- Tác động lâm sàng liên quan nhiều cơ quan: hệ thần kinh trung ƣơng, cơ xƣơng và cơ tim, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa.
- Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch não tủy.
- Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ não khơng bình thƣờng.
2.1.2. Các hóa chất, ngun liệu khác
Các vector pJET 1.2 mang đoạn gen chứa và không chứa các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C là sản phẩm của đề tài KC-04.10/11-15.
Kit tách chiết DNA tổng số và DNA plasmid đƣợc mua từ Qiagen (Đức); các cặp mồi và mẫu dò Taqman LNA đƣợc thiết kế theo yêu cầu của nghiên cứu và đạt mua từ Integrated DNA Technologies (IDT, Hoa Kỳ), dung dịch gốc (Master mix) cho real-time PCR đƣợc mua từ hãng Enzynomic (Hàn Quốc); các enzyme giới hạn đƣợc mua từ Thermo Sciencific (Hoa Kỳ).
Các hóa chất cịn lại đều đƣợc mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
2.1.3. Máy móc và trang thiết bị
Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy PCR gradient Mastercycler EP gradient S (Eppendorf, Đức), máy real-time PCR iQ5 cycler (Biorad, Hoa Kỳ), tủ ấm nuôi vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt (Satorius), máy ly tâm Sigma 30K, máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorf, Đức), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad, Hoa Kỳ) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad, Hoa kỳ).
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Biến nạp và nuôi cấy tế bào E. coli chứa plasmid mang đoạn gen có và khơng có đột biến gen ty thể. khơng có đột biến gen ty thể.
Để biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli DH5, tế bào khả biến (đƣợc xử lý trong điều kiện lạnh và có ion Ca2+, đƣợc bảo quản ở -80oC) đƣợc lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần.
Các vector mang đoạn gen đột biến và không đột biến (A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A) đƣơ ̣c bổ sung vào từng ống dung dịch tế bào riêng biệt , trộn nhẹ. Hỗn hơ ̣p đƣợc giữ hỗn hợp trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào và đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây. Hỗn hơ ̣p đƣơ ̣c đƣ a la ̣i giƣ̃ trên đá trong 5 phút. 600 l môi trƣờng nuôi cấy lỏng đƣơ ̣c bổ sung vào hỗn hợp biến nạp . Mẫu đƣơ ̣c ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 15 phút. Các tế bào sau đó đƣợc n i cấy l ắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37oC trong 60 phút để phục hồi các tế bào sau khi bị sốc nhiệt. Hỗn hơ ̣p đƣợc ly tâm nhẹ tế bào đã biến nạp ở 2300 vòng/phút trong 5 phút và loa ̣i bỏ 400µl di ̣ch trên tủa . Hỡn hợp còn la ̣i đƣợc trộn nhẹ tế bào và lấy 50µl cấy trải lên đĩa môi trƣờng nuôi cấy rắn có bổ sung kháng sinh ampicillin 50µg/ml. Các đĩa chứa tế bào biến nạp đƣợc nuôi cấy ở 37oC trong 10-12 giờ để quan sát đƣợc các khuẩn lạc rõ rệt. Mẫu đối chứng âm đƣợc thực hiện nhƣ trên tuy nhiên thay vì bổ sung vector mà bổ sung bằng nƣớc thay thế.
Các khuẩn lạc sau đó đƣợc chấm ra từ đĩa biến nạp và cho vào một ống facol chứa 5ml môi trƣờng ni cấy lỏng có bổ sung kháng sinh apicillin 50µg/ml. Các ống ni cấy đƣợc ni lắc trong điều kiện 200 vòng ở 37oC và trong 14-16 giờ. Đối chứng âm đƣợc thực hiện giống nhƣ trên nhƣng bổ sung nƣớc cất khử trùng thay cho khuẩn lạc.
2.2.2. Tách chiết và định lượng DNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm
DNA tổng số đƣợc tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân theo Kit của Qiagen, cụ thể gồm các bƣớc sau đây:
20 µl protease Qiagen và 200 µl mẫu máu đƣợc bổ sung vào một ống ependoff sạch. 200 µl đệm AL và 4 µl RNase 10 mg/ml đƣợc bổ sung. Hỗn hợp đƣợc trộn đều trong 15 giây để thu đƣợc một dung dịch đồng nhất và đƣợc ủ ở 56oC trong 10 phút. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm nhẹ 3.000 vịng/phút. 200 µl ethanol 100% đƣợc bổ sung, trộn đều và ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Dung dịch trong ống đƣợc chuyển vào cột Qiagen, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. 500 µl đệm AW1 đƣợc bổ sungvà đƣợc ly tâm ở 8.000 vịng/phút trong 1 phút, sau đó dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. 500 µl đệm AW2 đƣợc bổ sung, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và đƣợc bổ sung 150 µl nƣớc cất vơ trùng và để yên trong 1 phút, sau đó đƣợc ly tâm ở 8.000 vịng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là DNA tổng số. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
2.2.2.2. Tách chiết plasmid
Dịch nuôi cấy E. coli đƣợc ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối. 250µl đệm P1 có chứa RNAse 20µg/ml đƣợc bở sung , tủa tế bào đƣơ ̣c hịa trong đệm và sau đó đƣợc chuy ển sang ống eppendoff. 250µl đệm P2 đƣơ ̣c bở sung và trộn đều trong 4-6 lần sao cho dung dịch trở nên đồng nhất (trong thời gian khơng q 5 phút). 350µl đệm N3 đƣơ ̣c bở sung và tr ộn đều trong 4-6 lần. Hỗn hợp đƣơ ̣c ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, dịch nổi đƣợc thu la ̣i (chú ý không để lẫn phần tủa) và cho lên cột minispin. Cô ̣t đƣợc ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loa ̣i bỏ di ̣ch trên tủa.750µl đệm PE đƣợc bổ sung và h ỗn hợp đƣợc ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút và loa ̣i bỏ di ̣ch . 100 µl H2O đã khử trùng hoặc đệm PE đƣơ ̣c bổ sung vàcột minispin đƣợc chuyển sang ống eppendoff mới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu plasmid. Plasmid đƣơ ̣c bảo quản ở -20oC và sử dụng cho các mục đích tiếp theo.
2.2.2.3. Định lượng DNA bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm.
Nồng độ của DNA tách chiết đƣợc định lƣợng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở bƣớc sóng 260 nm (A260) trên máy NanoDrop. Trƣớc tiên 1µl đệm dùng để chiết DNA/plasmid trong quá trình tách
chiết và tinh sạch (có thể là H2O hoặc TE) đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để đƣa giá trị A260 của máy về giá trị zero trƣớc khi đo mẫu. Mẫu DNA đƣợc trộn đều, 1 µl mẫu đƣơ ̣c sử dụng để đo A260. Viê ̣c đo đƣợc lă ̣p la ̣i 3 lần để lấy giá trị trung bình.
2.2.3. Kỹ thuật đa hình phân cắt các đoạn giới hạn kết hợp với PCR (PCR-RFLP)
Nhằm kiểm tra các plasmid chắc chắn có chứa các đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A phƣơng pháp PCR-RFLP đƣợc sử dụng. Các đoạn gen chèn trong plasmid đƣợc khuếch đại bằng PCR và sản phẩm PCR sau đó đƣợc cắt với enzyme giới hạn thích hợp theo cách thức mà Trƣơng và tập thể đã thiết lập [53].
PCR đƣợc thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1), sử dụng DNA khuôn là plasmid. Thành phần của PCR bao gồm: 2,5 l đệm Taq DNA polymerase 10X; 1l Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ l); 2,5 l dNTPs 2 mM; 1 l mồi xuôi 10 pmol; 1 l mồi ngƣợc 10 pmol; 2 l DNA khuôn (20-25 ng/l) và 15l dd H2O cho tổng thể tích 25 l. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, đặt vào máy PCR và tiến hành chạy với 3 bƣớc chính: biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Mẫu đối chứng âm (không chứa DNA khn) đƣợc đặt cùng thí nghiệm để kiểm tra khả năng nhân bản không đặc hiệu.
Các sản phẩm PCR của mỗi loại đột biến sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn thích hợp tƣơng ứng. Phản ứng cắt đƣợc thực hiện với các thành phần nhƣ sau: 1 l đệm enzyme giới hạn 10X; 0,5l enzyme giới hạn (10 đơn vị/l); 7,5 l sản phẩm PCR và 6l ddH2O cho tổng thể tích 15 l, hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 37oC, từ 10-12 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và đột biến đƣợc phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại.
Bảng 2.1. Trình tự mồi chu trình nhiệt và kích thƣớc sản phẩm PCR Đột Đột
biến/Mồi Trình tự mồi Chế độ nhiệt
Sản phẩm
PCR
A3243G
Fw: 5’ CAA GAG AAA TAA GGC TTA CTT C 3’ (3134-3155)
Rv: 5’GGA GTA GGA GGT TAG CCA TGG G 3’ (3310-3331) 94o C: 30 giây 56 o C: 30 giây 72 o C: 30 giây 198 bp A8344G
Fw: 5’GGT ATA CTA CGG TCA ATG CTC 3’ (8155-8175).
Rv: 5’ TTT CAC TGT AAA GAG GTGTGG G 3’ (8366-8345) 94 o C: 30 giây 58 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút 212 bp G11778A
Fw 5’ CTT CAC CGG CGC AGT CAT TC 3’ (11683- 11702)
Rv 5’ GTT GTG GTA AAT ATG TAG AG 3’ (12000- 11981)
94 o C: 1 phút 56 o C: 1 phút
72 o C: 1 phút 318 bp
T8993G/C
Fw: 5’ CAA CTA ACC TCC TCG GAC 3’(8768-8785)
Rv: 5’ TGA AAA CGT AGG CTT GGA T 3’ (9169-9151)
94 o C: 10 giây 55 o C: 40 giây
72 o C: 1 phút 402 bp
G3380A
Fw: 5’-GGC ATT CCT AAT GCT TAC CGA TC-3(3357-3379) Rv: 5’-AGA TGT GGC GGG TTT TAG GG-3(3504-3485) 94 o C: 10 giây 55 o C: 40 giây 72 o C: 1 phút 148 bp
2.2.4. Điện di trên gel agarose và gel polyacylamide
Gel agarose 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. 5µl mẫu DNA đƣợc trộn đều với 1µl dung dịch đệm tra mẫu, tra lên giếng gel đã chuẩn bị trong đệm TAE 1X. Thang chuẩn DNA 100 bp đƣợc điện di song song cùng với mẫu. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu cách mép bản gel khoảng 2 cm (kích thƣớc bản gel dài x rộng là 6 x 5 cm). Bản gel chứa các băng DNA đƣợc ngâm trong Ethidium bromide ở nồng độ 50 µg/ml khoảng 5-10 phút và quan sát trên máy soi và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad).
Gel polyacrylamide 12% đƣợc trộn với các thành phần nhƣ sau: Dung dịch acrylamide 30% 2 ml, TBE 5X 1ml. APS 10% 35 µl, TEMED 3,5 µl và nƣớc cất khử trùng 2 ml. Hỗn hợp sau đó đƣợc đổ vào khay và lƣợc đã đã đƣợc lắp đặt sẵn. Sau 30 phút có thể sử dụng gel cho điện di.
Mẫu DNA đƣợc trộn với đệm mẫu và tra vào đƣờng chạy điện di trong đệm TAE 1X với hiệu điện thế ổn định 120volt cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 0,5 cm (kích thƣớc bản gel dài x rộng là 10 x 7 cm) thì dừng lại. Gel đƣợc nhuộm bằng EtBr nồng độ 50 µg/ml, sau khoảng 5-10 phút, bản gel đƣợc lấy ra, rửa dƣới vòi nƣớc và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel (Biorad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.5. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dị huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA)
Trong thí nghiệm này, mẫu dị huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dị có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) HEX (535/556 nm) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự không đột biến và FAM (495/520 nm) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự đột biến, cịn đầu 3’ của mẫu dị có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher). Ngoài ra, để tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dị, trong trình tự của mẫu dị cịn có nucleotide cải biến dạng khóa bằng cầu methyl (locked nucleic acid). Trình tự các mồi và mẫu dị huỳnh quang cho real-time PCR trình bày ở bảng 2.2.
Nguyên tắc của phƣơng pháp: Khi chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dị Taqman vẫn còn nguyên vẹn nên huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ, ống phản ứng sẽ không phát đƣợc huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có kéo dài mồi thì Taq DNA polymerase (nhờ có hoạt tính 5’-exonuclease) (do có hoạt tính 5’-exonuclease) tách reporter khỏi quencher, và sẽ phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lƣợng reporter tự do
càng nhiều và cƣờng độ huỳnh quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang.
Trong nghiên cứu này, các phản ứng real-time sử dụng mẫu dò huỳnh quang chứa tín hiệu HEX cho DNA khn khơng mang đột biến và mẫu dị chứa tín hiệu huỳnh quang FAM cho DNA khn mang đột biến. Do đó, khi kết thúc phản ứng real- time PCR, nếu chỉ thu đƣợc tín hiệu HEX chứng tỏ mẫu DNA khn không mang đột biến. Ngƣợc lại, nếu chỉ thu đƣợc tín hiệu FAM chứng tỏ DNA khuôn mang đột biến ở dạng đồng nhất và nếu thu đƣợc cả hai loại tín hiệu FAM và HEX thì chứng tỏ mẫu DNA khn mang đột biến ở dạng không đồng nhất.
Tiến hành phản ứng với đồng thời 4 mẫu chuẩn là các đối chứng dƣơng để dựng đƣờng chuẩn nhằm định lƣợng số bản sao của mẫu bệnh phẩm; đối chứng âm để kiểm tra dƣơng tính giả.
Thành phần phản ứng bao gồm 15 µl master mix (Taq DNA polymerase (5 đơn vị), dNTP, MgCl2, UNG (5 đơn vị), 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngƣợc, 2 pmol mẫu dò đột biến và 2 pmol mẫu dị khơng đột biến của từng đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C), DNA khuôn (15-25 ng), bổ sung nƣớc hoặc đệm TE 1X cho đến thể tích cuối cùng là 20 µl. Hỗn hợp đƣợc đặt vào máy real-time PCR. Lựa chọn các kênh màu huỳnh quang FAM và HEX, khai báo số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn và cài đặt với chu trình nhiệt: 50oC trong 4 phút cho hoạt hóa UNG, 95oC trong 10 phút cho biến tính ban đầu, 40 chu kì bao gồm 95oC trong 15 giây cho biến tính, 60oC trong 30 giây cho gắn mồi và kéo dài chuỗi.
Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, dựa trên số lƣợng bản sao đã biết của mẫu chuẩn mà máy tính ra số lƣợng bản sao đột biến và không đột biến của mẫu cần phân tích đồng thời cũng đƣa ra các thông số khác bao gồm hiệu suất PCR, hệ số tƣơng quan tuyến tính giữa chu kì ngƣỡng và số bản sao ban đầu.
Dựa trên kết quả số bản sao đột biến và không đột biến của mẫu cần phân tích hiển thị trên máy tính, tỷ lệ đột biến của mẫu bệnh phẩm đƣợc tính theo cơng thức:
Số bản sao đột biến (FAM) % Đột biến =
Số bản sao đột biến (FAM) + Số bản sao không đột biến (HEX)
2.2.6. Phương pháp thống kê.
Các mẫu đƣợc đo 3 lần và xử lí bằng phƣơng pháp thống kê, sử dụng hàm AVERAGE cho tính giá trị trung bình và tính sai số bằng cách sử dụng hàm tính độ lệch chuẩn STDEV trong Excel.
Bảng 2.2. Trình tự mồi và mẫu dị cho real-time PCR Đột biến Mồi/mẫu dị Trình tự Đột biến Mồi/mẫu dị Trình tự A3243G RT3243Fw 5’-CCACACCCACCCAAGAACAG-3’ RT3243Rv 5’-AGGAATTGA ACCTCTGACTGTAAAGTTTT-3’ Wt3243A-HEX 5’-/5HEX/CCGGGC+T+CTGCCAT/3IABkFQ/- 3’ Mt3243G-FAM 5’-/56FAM/CCGGGC+CCTGCCAT/3IABkFQ/- 3’ G3380A RT3380Fw 5’GGCCAACCTCCTACTCCTCAT-3’ RT3380Rv 5’CCTACAACGTTGGGGCCTTTG-3’ Wt3380G-HEX 5’/5HEX/ATT+T+TT+C+GTT+C+GGT/3IABk FQ-3’ Mt3380A-FAM 5’-/56FAM/AT+T +TT+T+GTT+C+GGT/3IABkFQ/-3’ A8344G RT8344Fw 5’ AGCCCACTGTAAAGCTAAC-3’ RT8344Rv 5’ GGC ATTTCACTGTAAAGAGGT-3’ Wt8344A-HEX 5’/5HEX/AGAT+TA+A+GA+GA+A+CC/3IAB kFQ/-3’ Mt8344G-FAM 5’- /56FAM/GAT+TA+A+GAG+A+GCC/3IABkFQ /-3’ T8993G T8993C
RT8993Fw 5’CGA AAC CAT CAG CCT ACT CAT TCA A-3’
RT8993Rv 5’ CCT GCA GTA ATG TTA GCG GTT AGG- 3’
Wt8993T-HEX 5’-/5HEX/AAT +AGC CC+T +GGC C/3IABkFQ-3’ Mt8993C-FAM 5’-/56FAM/ATA GCC C+CG GCC GT/3IABkFQ/-3’ Mt8993G-FAM 5’/56FAM/AATAGC+CC+GGGCCGT /3IABkFQ/-3’ G11778A
RT11778Fw 5'- CTG CCT AGC AAA CTC AAA CTA C-3' RT11778Rv 5'- GTG GGA GTA GAG TTT GAA GTC-3' Wt11778G- HEX 5’/5HEX/ATGATG+C+GA+C+TGTG /3IABkFQ/-3’ Mt11778A- FAM 5’/56FAM/AT+G+AT+G+T+GA+CTG /3IABkFQ/-3’
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN