2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.3. Xử lý hạt đậu tương với các dung dịch hạt nano kim loại
- Chuẩn bị môi trường thạch (agar): Đun sôi hỗn hợp thạch theo tỷ lệ 5 g thạch/1L nước cất. Đổ thạch vào các hộp nhựa sạch, mỗi hộp 450 ml (độ dày của lớp thạch trong hộp khoảng 3 cm), để thạch nguội hoàn toàn.
- Trộn hạt đậu tương đã khử trùng với dung dịch nano đã chuẩn bị theo tỷ lệ 100 g hạt/ 35 ml dung dịch nano siêu phân tán. Ủ hạt trong 30 phút, tại nhiệt độ phòng. Đối chứng âm là hạt đậu tương được ủ với nước cất khử ion. - Đặt hạt lên môi trường thạch, các hạt cách nhau 1 cm.
- Bổ sung 15 ml nước cất khử ion vô trùng vào mỗi hộp môi trường, đặt giấy thấm lên bề mặt hạt đậu tương và đóng nắp hộp.
- Đặt các hộp mẫu trong tối, ở nhiệt độ phịng. 2.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về hình thái
Tác động của các hạt nano kim loại sử dụng trong nghiên cứu đến quá trình nảy mầm của hạt đậu tương được đánh giá thông qua các chỉ tiêu về hình thái bao
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
gồm: tỷ lệ nảy mầm, hình thái rễ mầm và chồi mầm, tốc độ phát triển rễ mầm và chồi mầm.
2.3.4.1 . Tỷ lệ nảy mầm
Quan sát và đếm số hạt nảy mầm trong mỗi lơ thí nghiệm sau 15 giờ, 24 giờ và 48 giờ ( kể từ khi xử lý hạt). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Tỷ lệ nảy mầm (X%) ở mỗi lơ thí nghiệm được tính theo cơng thức:
X (%) =
2.3.4.2. Hình thái của rễ mầm và chồi mầm
Tốc độ phát triển rễ mầm: Chiều dài rễ mầm được đo tại các mốc thời gian 15 giờ, 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ (kể từ khi xử lý hạt), mỗi mốc thời gian đo 30 rễ mầm/lô thí nghiệm. Mỗi lơ thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Xác định chiều dài rễ bằng thước thẳng có độ chia nhỏ nhất 0,1 mm.
Tốc độ phát triển chồi mầm: Chiều dài chồi mầm được đo tại các thời điểm 15 giờ, 27 giờ, 39 giờ, 51 giờ và 63 giờ (kể từ khi xử lý hạt), mỗi mốc thời gian tiến hành thu 30 chồi mầm/lơ thí nghiệm, cho ngay vào dung dịch ethanol 70% để cố định. Mỗi lơ thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Quan sát, đo chiều dài bằng trắc vi thị kính, sử dụng kính hiển vi soi nổi Leica M80, độ phóng đại 20×.
2.3.5. Đánh giá ảnh hưởng của các hạt nano kim loại đến khả năng phân bào ở đỉnh sinh trưởng rễ sinh trưởng rễ
Rễ mầm đậu tương (khoảng 2 cm tính từ đỉnh rễ mầm) được thu vào thời điểm 48 giờ kể từ khi hạt nảy mầm và được cố định trong dung dịch Carnoy (3 ethanol: 1 acetic acid) trong thời gian 12 tiếng. Mẫu sau khi cố định được rửa 3 lần bằng ethanol 70%, sau đó được bảo quản trong ethanol 70% ở 4oC. Thủy phân mẫu bằng HCl 1M ở 60o trong 15 phút. Nhuộm mẫu bằng dung dịch thuốc nhuộm Fucshin trong 1 giờ. Phần đỉnh rễ mầm (khoảng 2 mm) được đặt lên lam kính và phủ với lamen, ép đỉnh rễ bằng lực nhẹ. Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chụp ảnh và đếm số lượng các tế bào đang phân chia trong tổng số 1000 tế bào trên mỗi tiêu bản rễ. Nhuộm và phân tích 10 đỉnh rễ trong mỗi lơ thí nghiệm, lặp lại thí
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
nghiệm 3 lần. Chỉ số phân bào được tính theo cơng thức [33].
Chỉ số phân bào (%) =
2.3.6. Đánh giá ảnh hưởng của các hạt nano kim loại đến quá trình nảy mầm của đậu tương ở mức độ phân tử đậu tương ở mức độ phân tử
Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến quá trình nảy mầm của đậu tương ở mức độ phân tử bước đầu được đánh giá thơng qua mức độ methyl hóa của hệ gen đậu tương và mức độ biểu hiện của 8 gen mã hóa cho các enzyme đóng vai trị quan trọng trong quá trình nảy mầm ở giai đoạn sớm bao gồm: gen mã hóa enzyme aminocyclopropane-1-carboxylase synthase (ACS2), lypoxygenase (LOX9-03,
LOX9-07), urease (URE02, URE14), β-amylase (AMY8, AMYS), alpha-glucan
dikinase (α-GLU); actin (Act 3.2) được sử dụng làm gen nội chuẩn.
2.3.6.1. Thu mẫu
Các mẫu rễ mầm đậu tương dùng cho các thí nghiệm sinh học phân tử được thu tại các mốc thời gian tương tự ở các thí nghiệm phân tích về hình thái. Mẫu được gói trong giấy bạc vơ trùng, đơng lạnh ngay lập tức bằng nitơ lỏng và được bảo quản ở tủ lạnh sâu -80oC. Các mẫu thu ở thời điểm 18 giờ và 48 giờ kể từ khi xử lý hạt sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm về đánh giá mức độ biểu hiện gen và mức độ methyl hóa hệ gen đậu tương.
2.3.6.2. Đánh giá ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến mức độ methyl hóa DNA
đậu tương ở giai đoạn nảy mầm
Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ mẫu rễ mầm bằng CTAB theo mô tả của Doyle Jeffrey (1991) [19] và có cải biến nhỏ để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm ở Việt Nam. Rễ mầm (1 g) được nghiền bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng thành bột mịn. Chuyển mẫu sang ống eppendorf loại 2 ml và bổ sung 800 µl đệm chiết (100 mM Tris – HCl (pH=8); 1,5 M NaCl; 50 mM EDTA (pH=8); 4% (w/v) CTAB) vào ống chứa mẫu. Đảo đều ống và ủ hỗn hợp ở 65°C trong 60 phút. Tiếp theo, bổ sung 800µl dung dịch chloroform : isoamylalcohol (24 : 1), ly tâm hỗn
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
hợp ở 13000 vòng trong 15 phút ở 20°C, chuyển lớp dung dịch ở phía trên sang ống eppendorf loại 1,5 ml. Bổ sung một lượng isopropanol tương đương với thể tích phần dung dịch có trong mỗi ống mẫu để kết tủa DNA. Thu cặn DNA sau khi ly tâm 13000 vịng trong 15 phút ở 20°C. Bổ sung 500 µl ethanol 70%, ly tâm 9000 vòng trong 5 phút ở 20°C và thu tủa. Làm khô tủa ở nhiệt độ phịng, sau đó hịa tan trong 30 µl nước khơng chứa DNase. Tiến hành điện di kiểm tra và bảo quản các mẫu DNA ở -20ºC.
Sau khi tách chiết, để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn RNA, DNA tổng số của các mẫu rễ mầm được làm sạch bằng cách bổ sung 1 µl RNase 10 mg/mL và ủ mẫu ở 37oC trong 2 giờ. Sau đó, bổ sung 1 µl EDTA, ủ ở 65oC trong 10 phút để dừng phản ứng. Tiếp tục bổ sung 0,1 V natriacetate 3M và 2V isopropanol 100% để kết tủa DNA. Thu tủa DNA bằng ly tâm 13000 vòng trong 15 phút. Tiếp tục bổ sung 500 µl ethanol 70% và ly tâm 9000 vịng trong 15 phút. Làm khơ và hịa tan DNA trong 30 µl nước không chứa DNase. Kiểm tra chất lượng DNA bằng máy Nanodrop.
Thủy phân DNA tổng số
Hàm lượng DNA tương đương 40 µg /25 µl phản ứng được chuẩn bị cho mỗi mẫu nghiên cứu. DNA sợi đôi được chuyển thành DNA sợi đơn bằng phương pháp biến tính ở 95oC trong 5 phút và chuyển ngay lập tức vào đá. Thủy phân DNA sợi đơn thành các nucleotide bằng cách bổ sung 2 µl enzyme nuclease P1 0,1U và ủ tại 37oC trong 4 giờ. Sau đó, dung dịch thủy phân được bổ sung 0,5 µl enzyme alkaline phosphatase 0,1U và 2,5 µl dephosphorylation buffer 10X , ủ tại 37oC trong 4 giờ. Ly tâm dung dịch phản ứng ở 10000 vòng trong 5 phút. Lớp dung dịch ở phía trên được thu lại và bảo quản ở -20oC để sử dụng cho phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Dựng đường chuẩn định lượng và xác định tỷ lệ methyl hóa DNA
Đường chuẩn định lượng có dạng y = ax + b được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích pic UV được chọn (y) và nồng độ tương ứng của chất chỉ thị
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
(x).
Chất chỉ thị Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan
Cytidine y = 17,24725x + 0,370997 0,99993 5-methylcytidine y = 16,96034x – 1,10853 0,99992
Hình 2. Đường chuẩn định lượng cytidine trong các mẫu phân tích
Hình 3. Đường chuẩn định lượng 5-methylcytidine trong các mẫu phân tích
Mức độ methyl hóa DNA tổng số là tỷ lệ phần trăm các nucleotide cytidine bị methyl hóa trong một gram DNA phân tích. Từ hàm lượng của cytidine và 5- methylcytidine trong mỗi gram DNA của mẫu, mức độ methyl hóa DNA tổng số ở
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
các mẫu rễ mầm được tính tốn theo cơng thức sau: [5dmC] [dC]+[5dmC]
Trong đó: % 5-mdC là tỷ lệ phần trăm các nucleotide cytidine bị methyl hóa, [dC] và [5dmC] là hàm lượng của cytidine và 5-methylcytidine của một gram DNA của mỗi mẫu.
2.3.6.3. Đánh giá ảnh hưởng của các hạt nano kim loại đến mức độ biểu hiện của một số gen trong quá trình nảy mầm của hạt đậu tương
Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết bằng TRizol theo mô tả của Rio và cộng sự (2010) [46] và có một số cải biến nhỏ. Rễ mầm (1 g) ở mỗi lơ thí nghiệm được nghiền bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng đến khi thành bột mịn. Sau đó, bổ sung 1 ml Trizol vào cối và chuyển mẫu vào ống eppendorf loại 2 ml. Tiếp tục bổ sung 200 µl chloroform : isoamyl alcohol (24:1) vào ống, trộn đều và ủ mẫu trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 13000 vòng trong 15 phút ở 4oC, thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 2 ml mới. Kết tủa RNA bằng cách bổ sung 2,5 thể tích ethanol 100% và 0,1 thể tích natriacetat 3M, để tủa qua đêm ở -20oC. Ly tâm 13000 vòng trong 15 phút ở 4oC để thu tủa RNA. Loại muối trong mẫu bằng cách bổ sung 500 µl ethanol 70%, ly tâm 9000 vòng trong 5 phút ở 4oC và thu tủa. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung 30 µl nước khử RNase để hịa tủa. Tiến hành điện di kiểm tra và bảo quản mẫu RNA tổng số ở -20oC.
Sau khi tách chiết, RNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương được loại DNA bằng cách bổ sung 2 µl buffer DNase/MgCl2 và 3 µl enzyme DNase 1U/µl, ủ mẫu ở 37oC trong 2 giờ. Tiếp theo, bổ sung 1 µl EDTA, ủ mẫu ở 65oC trong 10 phút để dừng phản ứng. Cuối cùng, đo nồng độ RNA bằng máy Nanodrop (Thermo scientific) để kiểm tra chất lượng.
Tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp từ khuôn RNA bằng bộ kit Revert Aid First Strand x 100
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific). Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ RNA làm khuôn trong một phản ứng tổng hợp cDNA là 3000 ng/µl.
RT-PCR
Các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi đoạn gen cần phân tích (Bảng 4) được thiết kế sử dụng phần mềm Primer Select (Lasergene, Mỹ), dựa trên những thơng tin về trình tự hệ gen đậu tương đã được cơng bố trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen quốc tế Genbank - NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) và Phytozome v11 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). Thành phần phản ứng RT-PCR được liệt kê ở Bảng 5. Chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng được thể hiện ở Bảng 6.
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Bảng 4. Thơng tin gen đích và các mồi được sử dụng trong phản ứng RT-PCR
Kí hiệu
gen đích Mã số gen Tên mồi Trình tự mồi
Kích thƣớc lý thuyết (bp) Act 3.2 Glyma.19g32990 Act3.2-F GACCTTCAACACCCCTGCTA 423 Act3.2-R ATGGATGGCTGGAACAGAAC ACS2 Glyma.08G018000 ACS2-F GTAGAACAAGAGGAAACAGAGTC 389 ACS2-R AGATACAAGATGGATACGCTTC LOX9-03 Glyma.03G237300 LOX9-03-F GCGTGCTTCACCCTATTTAT 360 LOX9-03-R CTGTGTCATCTTCCTTGTAGTAG LOX9-07 Glyma.07G007000 LOX9-07-F GAAGATGTGCGTAGTCTCTATGA 424 LOX9-07-R CAGTAGGTAGGCTGTTTATCCT AMY8 Glyma.09G21700 AMY8-F GTATCCTGGTATCGGTGAGTT 450 AMY8-R CTGGAAGATGAAATCCTAAGC AMYS Glyma.05G219200 AMYS-F GTTTACGATTGGAGAGGGTATG 388 AMYS-R CCTGTGAAGAGAATGAAGGATA α-GLU Glyma.04G096500 α-GLU-F GGAATAGCTATCTAACTGGAGGA 424 α-GLU-R CTATTCCCTGCAAAGTTATCTC URE02 Glyma.02G163900 URE02-F GACGGTAGAGGAAGAATAATGAG 292 URE02-R TGTAAACCTTAGTGGAACCTTG
URE14 Glyma.14G039400 URE14-F GTTCAGTCCCACTTAGTGTCTAAT 292
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu Bảng 5. Thành phần của phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích H2O - 16 µl Buffer ( khơng có MgCl2) 10X 2,5 µl dNTP mix 2,5 mM 2 µl MgCl2 25mM 2 µl Mồi xi (F) 10 pm 0,5 µl Mồi ngƣợc (R) 10 pm 0,5 µl
Dream Taq polymerase 5u/µl 0,5 µl
cDNA - 1 µl
Tổng 25 µl
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR
Các giai đoạn Các bƣớc của phản
ứng Nhiệt độ Thời gian
Chu kỳ
Giai đoạn 1 Biến tính ban đầu 95oC 10 phút 1 Giai đoạn 2
Bước 1. Biến tính 95oC 45 giây
35 Bước 2. Gắn mồi 54oC 45 giây
Bước 3. Tổng hợp 72oC 1 phút Giai đoạn 3 Hồn thiện chu trình 72o
C 7 phút 1
Giai đoạn 4 Kết thúc phản ứng 10o
C ∞ 1
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu trong nghiên cứu được thống kê và xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và GraphPad Prism 5.0, sử dụng kiểm định Tukey với p < 0,05. Các số liệu phân tích HPLC được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng theo hệ thống HPLC (Aligent, Mỹ) tại Viện Hóa sinh biển.
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của hạt nano kim loại đến tỷ lệ nảy mầm và tốc độ nảy mầm của hạt đậu tƣơng của hạt đậu tƣơng
Để đánh giá ảnh hưởng của hạt nano kim loại tới quá trình nảy mầm, hạt đậu tương ĐT26 trước khi gieo được ủ với các dung dịch nano kim loại ở các nồng độ khác nhau bao gồm: nFe (25 mg/L, 50 mg/L, 250 mg/L); nCu (5 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L); nZnO (25 mg/L, 50 mg/L, 500 mg/L); nCo 0,05 mg/L, 0,5 mg/L, 2,5 mg/L). Các nồng độ nano thử nghiệm được lựa chọn dựa trên kết quả của những thí nghiệm sơ bộ do đơn vị chế tạo vật liệu nano (Viện Công nghệ Môi trường) thực hiện và tham khảo những nghiên cứu trước đó về tác động của chế phẩm nano kim loại trên các đối tượng cây trồng. Tồn bộ q trình nảy mầm được theo dõi và quan sát theo từng mốc thời gian để đảm bảo phân tích một cách tổng thể và chi tiết sự thay đổi giữa các lô xử lý nano và lô đối chứng. Tỷ lệ nảy mầm là tiêu chí quan trọng đầu tiên để đánh giá khả năng nảy mầm của hạt giống. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương ở các lơ thí nghiệm được phân tích ở 3 mốc thời gian 15 giờ, 24 giờ và 48 giờ kể từ khi xử lý hạt.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc xử lý hạt đậu tương trước khi gieo với các dung dịch nano kim loại (nFe, nZnO, nCu và nCo) ở các nồng độ thử nghiệm đều làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt so với đối chứng. Sự khác biệt giữa các lô xử lý với hạt nano kim loại và lô đối chứng được thể hiện rõ nhất ở thời điểm 15 giờ sau khi xử lý (thời điểm hạt bắt đầu nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm đạt trên 30% ở lô đối chứng). Tỷ lệ nảy mầm ở các lô hạt được xử lý với 50 mg /L nFe, 50 mg/L nZnO, 50 mg/L nCu và 0,05 mg/L nCo lần lượt đạt 62,19%; 57,62%; 66,41% và 50%, trong khi đó lơ đối chứng chỉ đạt 39,19% (Bảng 7).
Đến thời điểm 24 giờ và 48 giờ, tỷ lệ nảy mầm ở lô đối chứng và các lô hạt được xử lý với dung dịch nano tương đương nhau, trung bình là 94%, trừ lơ hạt xử lý với 50 mg/L nFe, 250 mg/L nFe và 50 mg/L nCu*, với tỷ lệ nảy mầm lên đến 97% và 99%. Những kết quả trên cho thấy, các hạt nano kim loại có tác động thúc đẩy hạt nảy mầm sớm hơn 4 giờ, so với đối chứng. Trong các nồng độ nano xử lý,
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
các nồng độ cho hiệu quả cao là 250 mg/L nFe, 50 mg/L nFe, 50 mg/L nCu, 50 mg/L nZnO và 0,05 mg/L nCo. Ngồi ra, khơng có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ nảy mầm ở các lô hạt được xử lý với hạt nano kim loại sản xuất từ Dự án (Viện Cơng nghệ Mơi trường) và hạt nano có nguồn gốc từ cơng ty thương mại của Mỹ.
Bảng 7. Ảnh hưởng của nFe, nCu, nZnO và nCo đến tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương