tƣơng
3.5.1. Tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số là bước đầu tiên cho hầu hết các phân tích liên quan đến hệ gen. Tách chiết DNA bằng đệm CTAB là phương pháp được sử dụng phổ biến để tách chiết DNA từ các mẫu thực vật. CTAB là chất tẩy rửa có khả năng phá vỡ hệ thống màng tế bào và loại polysaccharide khỏi DNA tổng số [55]. DNA sau khi tách chiết từ các mẫu rễ mầm thu ở thời điểm 18 giờ và 48 giờ sau khi xử lý
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả cho thấy, các băng DNA tách chiết từ các mẫu nghiên cứu đều rõ nét (Hình 7).
Hình 7. Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 giờ (A) và 48 giờ (B) sau xử lý hạt (Các mẫu kí hiệu theo bảng 11 và bảng 12)
Sau khi làm sạch, hàm lượng DNA cũng như các chỉ số A260/280 và A260/230 được kiểm tra bằng máy Nanodrop. Kết quả đo quang phổ cho thấy, mẫu DNA tách từ các mẫu rễ mầm đậu tương 18 giờ và 48 giờ đều có chỉ số A260/280 nằm trong khoảng 1,8 - 2, chỉ số A260/230 dao động quanh mức 2 (Bảng 11 và Bảng 12). Như vậy, các mẫu DNA đều đảm bảo độ tinh sạch và có đủ chất lượng dùng cho các thử nghiệm tiếp theo
Bảng 11. Kết quả đo quang phổ các mẫu DNA tách từ mẫu rễ mầm 18 giờ
Kí hiệu mẫu Lơ xử lý
(mg/L) Nồng độ DNA (ng/µl) A260/280 A260/230 18.1 ĐC 299,1 1,97 2,05 18.2 50 nFe 204,9 1,96 2,03 18.3 50 nFe* 414,5 1,98 2,10 18.4 50 nCu 225,3 1,96 2,00 18.5 50 nCu* 575,2 1,96 2,03 18.6 50 nZnO 223,7 1,97 2,04 18.7 0,05 nCo 718,8 1,99 2,02 18.8 0,05 nCo* 285,2 1,96 2,00
ĐC: đối chứng; *: Hạt nano thương mại (Mỹ)
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
Bảng 12. Kết quả đo quang phổ các mẫu DNA tách từ mẫu rễ mầm 48 giờ
Kí hiệu mẫu Lơ xử lý
(mg/L) Nồng độ DNA (ng/µl) A260/280 A260/230 48.1 ĐC 131,9 1,93 2,04 48.2 50 nFe 137,6 1,89 2,03 48.3 50 nFe* 152,4 1,89 2,08 48.4 50 nCu 140,9 1,88 2,07 48.5 50 nCu* 141,3 1,88 2,09 48.6 50 nZnO 175,7 1,93 2,00 48.7 0,05 nCo 151,2 1,91 2,05 48.8 0,05 nCo* 137,0 1,88 2,00
ĐC: đối chứng; *: Hạt nano thương mại (Mỹ)
3.5.2. Phân tích mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 18 giờ
Kết quả đánh giá mức độ methyl hóa của 8 mẫu rễ đậu tương 18 giờ được thể hiện ở Bảng 13.
Bảng 13. Mức độ methyl hóa DNA ở các mẫu rễ mầm 18 giờ
Ký hiệu mẫu DNA
Thông tin mẫu thực vật Hàm lƣợng cytidine (mg/g) Hàm lƣợng 5-methylcytidine (mg/g) Mức độ methyl hóa DNA (%) 18.1 ĐC 16,712 0,255 1,503 18.2 50 mg/L nFe 16,162 0,407 2,456 18.3 50mg/L nFe* 15,067 0,181 1,187 18.4 50 mg/L nCu 25,314 0,555 2,145 18.5 50 mg/L nCu* 7,361 0,129 1,722 18.6 50 mg/L nZnO 13,809 0,290 2,057 18.7 0,05 mg/L nCo 29,036 0,256 0,874 18.8 0,05 mg/L nCo* 6,561 0,152 2,264
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
Tỷ lệ methyl hóa DNA ở các mẫu rễ mầm 18 giờ dao động từ 0,874% (mẫu xử lý với nCo) đến 2,456% (mẫu xử lý với nFe). Có thể thấy tỷ lệ methyl hóa giữa đối chứng khơng xử lý nano và các mẫu xử lý nano có sự khác nhau rõ rệt. Tỷ lệ methyl hóa ở một số mẫu xử lý với hạt nano kim loại thấp hơn so với ở mẫu đối chứng (1,503%) như ở mẫu nFe* (1,187%) và nCo (0,874%). Ngược lại, một số mẫu xử lý nano kim loại như nFe (2,456%), nCu (2,145%), nCu* (1,722%), nZnO (2,057%) và nCo* (2,246%) lại cao hơn hẳn so với đối chứng.
3.5.3. Phân tích mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 48 giờ
Kết quả định lượng cytidine, 5-methylcytidine và tỷ lệ methyl hóa của 8 mẫu DNA tách từ rễ mầm đậu tương ở giai đoạn 48 giờ được thể hiện ở Bảng 14.
Bảng 14. Mức độ methyl hóa DNA ở các mẫu rễ mầm 48 giờ
Ký hiệu mẫu DNA
Thông tin mẫu thực vật Hàm lƣợng Cytidine (mg/g) Hàm lƣợng 5-methylcytidine (mg/g) Mức độ methyl hóa DNA (%) 48.1 ĐC 53,458 0,726 1,340 48.2 50 mg/L nFe 36,968 0,498 1,329 48.3 50 mg/L nFe* 30,086 0,463 1,516 48.4 50 mg/L nCu 64,225 0,977 1,498 48.5 50 mg/L nCu* 20,486 0,194 0,938 48.6 50 mg/L ZnO 20,166 0,210 1,031 48.7 0,05 mg/L nCo 24,717 0,324 1,294 48.8 0,05 mg/L nCo* 30,459 0,315 1,024
ĐC: đối chứng không xử lý nano; *: hạt nano thương mại (Mỹ)
Như vậy, tỷ lệ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 48 giờ được xử lý nano kim loại đều biến động khác nhau và khác so với mẫu đối chứng. Có 4 mẫu xử lý nano là nCu*, nZnO, nCo và nCo* có tỷ lệ methyl hóa thấp hơn so với ở mẫu đối chứng không xử lý nano kim loại (1,34%). Trong đó, mẫu có tỷ lệ methyl hóa thấp nhất là nano Cu* (0,938%).
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
và một số trường hợp hiếm m6A (N6 methyl adenine) trong ty thể. Sự methyl hóa ở thực vật được kiểm soát bởi các hormone và những thay đổi trong quá trình nảy mầm, ra hoa và chịu ảnh hưởng của các mầm bệnh như virut, vi khuẩn, nấm. Methyl hóa DNA có vai trị kiểm sốt sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng, đặc biệt liên quan đến việc điều hòa sự biểu hiện gen và sao chép DNA [57]. Sự methyl hóa trong các vùng DNA điều khiển có vai trị ngăn cản q trình phiên mã của các gen tương ứng dẫn đến các gen này không được biểu hiện. Do vậy, quá trình biểu hiện gen thường tỷ lệ nghịch với tỷ lệ methyl hóa của DNA trong tế bào. Tỷ lệ methyl hóa tương ứng với độ đóng mở (độ hoạt động) của gen. Thơng thường, gen được kích hoạt và biểu hiện khi vùng điều khiển của gen đó được giải methyl hóa (demethylation) theo cơ chế hoạt hóa của tế bào dựa trên các tín hiệu ngoại bào và hormone sinh trưởng. Vì thế, có thể giải thích hiện tượng giảm mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm của lô xử lý nano so với mẫu đối chứng là do sự tăng cường biểu hiện của một số gen liên quan tới quá trình phát triển rễ mầm.
Ngồi các mẫu xử lý nano có tỷ lệ methyl hóa cao hơn so với mẫu đối chứng, hai mẫu rễ mầm ở lô xử lý nano nFe* và nCu lại dẫn tới tăng tỷ lệ methyl hóa so với mẫu đối chứng (Bảng 14). Điều này cũng có thể giải thích do tác động của hạt nano kim loại dẫn tới giảm sự biểu hiện hoặc ức chế một số gen.
Khi so sánh mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 18 giờ và 48 giờ đối với từng lô xử lý hạt nano kim loại (Bảng 13 và Bảng 14), có thể nhận mẫu xử lý nFe* có tỷ lệ methyl hóa thấp hơn của đối chứng ở giai đoạn rễ 18 giờ nhưng lại cao hơn so với đối chứng ở giai đoạn 48 giờ. Ngược lại với mẫu xử lý nCu*, nZnO và mẫu nCo*, ở giai đoạn 18 giờ, tỷ lệ methyl hóa cao hơn nhiều so với đối chứng nhưng ở giai đoạn 48 giờ lại thấp hơn so với đối chứng.
Như vậy ảnh hưởng của các hạt nano kim loại lên quá trình nảy mầm rất phức tạp, cần tiếp tục nghiên cứu sự biểu hiện của từng nhóm gen, từng gen riêng biệt và ở các giai đoạn phát triển khác nhau để làm rõ cơ chế tác động của từng loại hạt nano đối với sự biểu hiện gen
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận 3.6. Ảnh hƣởng của hạt nano kim loại đến sự biểu hiện của một số gen liên
quan đến quá trình nảy mầm của hạt đậu tƣơng
3.6.1. Tách chiết RNA tổng số
Tách chiết RNA tổng số là khâu đầu tiên trong các bước phân tích mức độ biểu hiện gen ở các mẫu nghiên cứu. RNA tổng số của 8 mẫu rễ mầm 18 giờ ký hiệu từ 18.1 đến 18.8 tương ứng với các lô xử lý (Bảng 15) và 8 mẫu rễ mầm 48 giờ ký hiệu từ 48.1 đến 48.8 tương ứng với các lô xử lý (Bảng 16) được tách chiết bằng phương pháp Trizol. Sau khi tách chiết, 5µl mẫu được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Kết quả ở Hình 8 cho thấy, ở tất cả các mẫu tách chiết đều xuất hiện 2 băng rRNA (18S và 26S) rõ nét. Như vậy, đã tách được RNA tổng số từ các mẫu rễ mầm đậu tương 18 giờ và 48 giờ.
Hình 8. Ảnh điện di RNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 giờ (A) và 48 giờ (B) sau xử lý hạt.(Các mẫu ký hiệu theo bảng 15 và bảng 16)
Để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn DNA, các mẫu RNA tổng số sẽ được làm sạch với DNase. Sau khi làm sạch, mẫu RNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương 18 giờ và 48 giờ được đo nồng độ và xác định các chỉ số liên quan đến độ tinh sạch (A260/280, A260/230) bằng máy Nanodrop. Trong đó, chỉ số A260/230 xác định sự có mặt của carbohydrate và hợp chất chứa nhóm phenol; chỉ số A260/280 xác định sự có mặt của protein. RNA được cho là “sạch” nếu chỉ số A260/280 nằm trong
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
khoảng 1,8 – 2,1 và A260/230 đạt tối ưu là 2,0. Kết quả đo quang phổ của các mẫu RNA tổng số tách từ mẫu rễ mầm đậu tương 18 giờ (Bảng 15) và 48 giờ (Bảng 16) cho thấy, tất cả các mẫu đều có nồng độ cao dao động từ 718 – 982 ng/µl, đồng thời các chỉ số A260/280 và A260/230 cũng nằm trong mức cho phép. Như vậy, RNA tổng số của các mẫu rễ mầm 18 giờ và 48 giờ đảm bảo đủ chất lượng để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 15. Kết quả đo quang phổ mẫu RNA tách từ các mẫu rễ mầm 18 giờ
Kí hiệu mẫu Lô xử lý
(mg/L) Nồng độ RNA (ng/µl) A260/280 A260/230 18.1 ĐC 849,7 1,97 1,96 18.2 50 nFe 827,3 1,97 2,00 18.3 50 nFe* 770,1 1,93 1,98 18.4 50 nCu 982,3 1,98 1,91 18.5 50 nCu* 962,6 1,97 2,04 18.6 50 nZnO 741,4 1,93 2,08 18.7 0,05 nCo 718,8 1,97 2,01 18.8 0,05 nCo* 945,8 1,94 1,95
ĐC: đối chứng; *: Hạt nano thương mại (Mỹ)
Bảng 16. Kết quả đo quang phổ mẫu RNA tách từ các mẫu rễ mầm 48 giờ
Kí hiệu mẫu Lơ xử lý
(mg/L) Nồng độ RNA (ng/µl) A260/280 A260/230 48.1 ĐC 496,5 2,01 2,06 48.2 50 nFe 880,3 2,00 2,00 48.3 50 nFe* 594,9 1,86 2,08 48.4 50 nCu 448,9 1,91 2,09 48.5 50 nCu* 595,2 1,99 2,04 48.6 50 nZnO 580,5 1,99 2,08 48.7 0,05 nCo 556,8 1,99 2,01 48.8 0,05 nCo* 585,2 1,97 1,95
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
3.6.2. Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến sự biểu hiện của một số gen liên quan đến quá trình nảy mầm của hạt đậu tương
Nảy mầm của hạt là một quá trình sinh lý phức tạp, được điều khiển bởi các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,… và các yếu tố bên trong như hoạt động của các hormone thực vật, mức độ biểu hiện gen,… Các yếu tố môi trường và tín hiệu hormone có sự tương tác với nhau để điều khiển q trình nảy mầm thơng qua việc điều khiển sự hoạt động của các gen liên quan [13]. Ngược lại, sự biểu hiện gen ở các mức độ khác nhau cũng có vai trị kiểm sốt hoạt động của hormone thực vật. Do đó, điều chỉnh mức độ biểu hiện gen là một trong những phương thức hiệu quả để tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [36]. Nhằm tìm hiểu tác động của việc xử lý nano kim loại tới khả năng nảy mầm và phát triển rễ mầm ở đậu tương, trong nghiên cứu này 8 gen có vai trị quan trọng trong q trình nảy mầm ở hạt giai đoạn sớm (18 - 48 giờ) được lựa chọn và phân tích bằng phương pháp RT- PCR. Các gen nghiên cứu bao gồm: gen mã hóa cho enzyme aminocyclopropane-1- carboxylase synthase, là enzyme chủ chốt trong con đường sinh tổng hợp ethylene, hormone có liên quan tới sự phá ngủ nghỉ, có vai trị kích thích nảy mầm ở giai đoạn sớm [16]; gen mã hóa cho các enzyme liên quan tới q trình trao đổi chất và giải phóng năng lượng từ các chất dự trữ trong hạt như lypoxygenase (trao đổi chất lipid), β-amylase và alpha-glucan dikinase (trao đổi chất carbohydrate) [22]; gen mã hóa cho enzyme urease, enzyme có nhiều trong rễ cây họ đậu, có vai trị phân giải ure tạo nguồn cung cấp nitơ cho cây [44]. Mẫu rễ mầm của các lơ thí nghiệm tại hai mốc 18 giờ và 48 giờ được lựa chọn để phân tích mức độ biểu hiện của 8 gen trên.
Kết quả phân tích cho thấy, việc xử lý hạt đậu tương trước khi gieo với các dung dịch nano kim loại đã có tác động rõ rệt tới sự biểu hiện của 8 gen nghiên cứu ở các mẫu rễ mầm giai đoạn 18 giờ (Hình 9) và 48 giờ (Hình 10).
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
Hình 9. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của 8 gen nghiên cứu ở các mẫu rễ mầm 18 giờ ((-): đối chứng âm của phản ứng RT-PCR, ĐC: đối chứng không xử lý nano; ACS2:
Aminocyclopropane-1-carboxylase synthase 2, LOX9-03: Lypoxygenase 3, LOX9-07: Lypoxygenase 7, AMY8: Amylase 8, AMYS: Saccharogen amylase, α-GLU: alpha-glucan dikinase,URE02: Urease 2, URE14: Urease 14)
Mức độ biểu hiện của gen nội chuẩn Act3.2 ở tất cả các mẫu là tương đương nhau, chứng tỏ sự khác biệt về mức độ biểu hiện của các gen nghiên cứu ở các mẫu rễ mầm là có ý nghĩa.
Đối với mẫu rễ mầm 18 giờ, các gen ACS2, LOX9-07, AMY8, α-GLU, URE02 không biểu hiện ở mẫu đối chứng không xử lý nano nhưng lại được tăng
cường biểu hiện ở các mẫu xử lý với các dung dịch nano kim loại. Trong các mẫu xử lý nano, mức độ biểu hiện của gen ACS2 và URE02 là tương đương, ngoại trừ sự biểu hiện yếu hơn của gen ACS2 ở mẫu xử lý với 0,05 mg/L nCo; gen AMY8 biểu hiện mạnh nhất ở rễ mầm của lô xử lý với 50 mg/L nFe và 50 mg/L nZnO. Gen
LOX9-03 chỉ biểu hiện ở mẫu rễ mầm của lô xử lý với 50 mg/L nFe*, 50 mg/L
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
50 mg/L nFe và 50 mg/L nZnO. Mức độ biểu hiện của gen URE14 ở lô xử lý với 50 mg/L nZnO cao hơn so với các lô xử lý với hạt nano khác và lô đối chứng. Tác động của hạt nano sản xuất từ dự án và hạt nano thương mại đến mức độ biểu hiện gen khơng có sự khác biệt đáng kể, trừ mẫu xử lý với nFe và nFe*. Ở giai đoạn này, 50 mg/L nZnO có tác động tốt nhất đến sự hoạt hóa và tăng cường biểu hiện của 8 nghiên cứu (Hình 9).
Hình 10. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của 8 gen nghiên cứu ở các mẫu rễ mầm 48 giờ ((-): đối chứng âm của phản ứng RT-PCR, ĐC: đối chứng không xử lý nano; ACS2:
Aminocyclopropane-1-carboxylase synthase 2, LOX9-03: Lypoxygenase 3, LOX9-07: Lypoxygenase 7, AMY8: Amylase 8, AMYS: Saccharogen amylase, α-GLU: alpha-glucan dikinase,URE02: Urease 2, URE14: Urease 14)
Đối với mẫu rễ mầm 48 giờ, hầu hết các gen phân tích (trừ gen LOX9-07, AMYS) vẫn được biểu hiện mạnh ở rễ mầm của các lô xử lý với dung dịch nano kim
loại, so với đối chứng. Gen AMY8 biểu hiện đồng đều ở các mẫu rễ mầm xử lý với hạt nano kim loại, trong khi lơ đối chứng khơng biểu hiện. Gen LOX9-03 có sự tăng cường biểu hiện rõ rệt ở mẫu xử lý với 50 mg/L nZnO. So với thời điểm 18 giờ,
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
biểu hiện của gen α-GLU đã được tăng mức độ biểu hiện ở các mẫu xử lý với 50 mg/L nCu, 50 mg/L nZnO và 0,05 mg/L nCo. Gen URE02 biểu hiện mạnh hơn ở