Kí hiệu
gen đích Mã số gen Tên mồi Trình tự mồi
Kích thƣớc lý thuyết (bp) Act 3.2 Glyma.19g32990 Act3.2-F GACCTTCAACACCCCTGCTA 423 Act3.2-R ATGGATGGCTGGAACAGAAC ACS2 Glyma.08G018000 ACS2-F GTAGAACAAGAGGAAACAGAGTC 389 ACS2-R AGATACAAGATGGATACGCTTC LOX9-03 Glyma.03G237300 LOX9-03-F GCGTGCTTCACCCTATTTAT 360 LOX9-03-R CTGTGTCATCTTCCTTGTAGTAG LOX9-07 Glyma.07G007000 LOX9-07-F GAAGATGTGCGTAGTCTCTATGA 424 LOX9-07-R CAGTAGGTAGGCTGTTTATCCT AMY8 Glyma.09G21700 AMY8-F GTATCCTGGTATCGGTGAGTT 450 AMY8-R CTGGAAGATGAAATCCTAAGC AMYS Glyma.05G219200 AMYS-F GTTTACGATTGGAGAGGGTATG 388 AMYS-R CCTGTGAAGAGAATGAAGGATA α-GLU Glyma.04G096500 α-GLU-F GGAATAGCTATCTAACTGGAGGA 424 α-GLU-R CTATTCCCTGCAAAGTTATCTC URE02 Glyma.02G163900 URE02-F GACGGTAGAGGAAGAATAATGAG 292 URE02-R TGTAAACCTTAGTGGAACCTTG
URE14 Glyma.14G039400 URE14-F GTTCAGTCCCACTTAGTGTCTAAT 292
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu Bảng 5. Thành phần của phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích H2O - 16 µl Buffer ( khơng có MgCl2) 10X 2,5 µl dNTP mix 2,5 mM 2 µl MgCl2 25mM 2 µl Mồi xi (F) 10 pm 0,5 µl Mồi ngƣợc (R) 10 pm 0,5 µl
Dream Taq polymerase 5u/µl 0,5 µl
cDNA - 1 µl
Tổng 25 µl
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR
Các giai đoạn Các bƣớc của phản
ứng Nhiệt độ Thời gian
Chu kỳ
Giai đoạn 1 Biến tính ban đầu 95oC 10 phút 1 Giai đoạn 2
Bước 1. Biến tính 95oC 45 giây
35 Bước 2. Gắn mồi 54oC 45 giây
Bước 3. Tổng hợp 72oC 1 phút Giai đoạn 3 Hồn thiện chu trình 72o
C 7 phút 1
Giai đoạn 4 Kết thúc phản ứng 10o
C ∞ 1
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu trong nghiên cứu được thống kê và xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và GraphPad Prism 5.0, sử dụng kiểm định Tukey với p < 0,05. Các số liệu phân tích HPLC được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng theo hệ thống HPLC (Aligent, Mỹ) tại Viện Hóa sinh biển.
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của hạt nano kim loại đến tỷ lệ nảy mầm và tốc độ nảy mầm của hạt đậu tƣơng của hạt đậu tƣơng
Để đánh giá ảnh hưởng của hạt nano kim loại tới quá trình nảy mầm, hạt đậu tương ĐT26 trước khi gieo được ủ với các dung dịch nano kim loại ở các nồng độ khác nhau bao gồm: nFe (25 mg/L, 50 mg/L, 250 mg/L); nCu (5 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L); nZnO (25 mg/L, 50 mg/L, 500 mg/L); nCo 0,05 mg/L, 0,5 mg/L, 2,5 mg/L). Các nồng độ nano thử nghiệm được lựa chọn dựa trên kết quả của những thí nghiệm sơ bộ do đơn vị chế tạo vật liệu nano (Viện Công nghệ Môi trường) thực hiện và tham khảo những nghiên cứu trước đó về tác động của chế phẩm nano kim loại trên các đối tượng cây trồng. Tồn bộ q trình nảy mầm được theo dõi và quan sát theo từng mốc thời gian để đảm bảo phân tích một cách tổng thể và chi tiết sự thay đổi giữa các lô xử lý nano và lô đối chứng. Tỷ lệ nảy mầm là tiêu chí quan trọng đầu tiên để đánh giá khả năng nảy mầm của hạt giống. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương ở các lơ thí nghiệm được phân tích ở 3 mốc thời gian 15 giờ, 24 giờ và 48 giờ kể từ khi xử lý hạt.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc xử lý hạt đậu tương trước khi gieo với các dung dịch nano kim loại (nFe, nZnO, nCu và nCo) ở các nồng độ thử nghiệm đều làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt so với đối chứng. Sự khác biệt giữa các lô xử lý với hạt nano kim loại và lô đối chứng được thể hiện rõ nhất ở thời điểm 15 giờ sau khi xử lý (thời điểm hạt bắt đầu nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm đạt trên 30% ở lô đối chứng). Tỷ lệ nảy mầm ở các lô hạt được xử lý với 50 mg /L nFe, 50 mg/L nZnO, 50 mg/L nCu và 0,05 mg/L nCo lần lượt đạt 62,19%; 57,62%; 66,41% và 50%, trong khi đó lơ đối chứng chỉ đạt 39,19% (Bảng 7).
Đến thời điểm 24 giờ và 48 giờ, tỷ lệ nảy mầm ở lô đối chứng và các lô hạt được xử lý với dung dịch nano tương đương nhau, trung bình là 94%, trừ lơ hạt xử lý với 50 mg/L nFe, 250 mg/L nFe và 50 mg/L nCu*, với tỷ lệ nảy mầm lên đến 97% và 99%. Những kết quả trên cho thấy, các hạt nano kim loại có tác động thúc đẩy hạt nảy mầm sớm hơn 4 giờ, so với đối chứng. Trong các nồng độ nano xử lý,
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
các nồng độ cho hiệu quả cao là 250 mg/L nFe, 50 mg/L nFe, 50 mg/L nCu, 50 mg/L nZnO và 0,05 mg/L nCo. Ngồi ra, khơng có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ nảy mầm ở các lô hạt được xử lý với hạt nano kim loại sản xuất từ Dự án (Viện Cơng nghệ Mơi trường) và hạt nano có nguồn gốc từ cơng ty thương mại của Mỹ.
Bảng 7. Ảnh hưởng của nFe, nCu, nZnO và nCo đến tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương
Lơ thí nghiệm
(mg/L)
Tỷ lệ nảy mầm (%)
15 giờ 24 giờ 48 giờ
ĐC 39,19 ± 2,11a 80,26 ± 4,43a 93,42 ± 4,21a 25 nFe 49,98 ± 2,50b 86,58 ± 4,14a 96,64 ± 4,71a 50 nFe 62,19 ± 2,33c 83,89 ± 4,01a 97,99 ± 4,04b 250 nFe 46,95 ± 2,34b 90,79 ± 4,48b 99,34 ± 4,59b 50 nFe* 49,12 ± 2,57b 88,39 ± 3,87b 97,42 ± 4,67b 25 nZnO 39,47 ± 2,43a 75,16 ± 3,01a 91,58 ± 4,01a 50 nZnO 57,62 ± 2,56c 82,27 ± 3,33a 94,74 ± 4,05a 500 nZnO 49,33 ± 2,60b 76,78 ± 3,08a 92,17 ± 3,84a 5 nCu 48,54 ± 2,48b 88,67 ± 3,75b 96,67 ± 4,91a 25 nCu 52,95 ± 2,84b 83,33 ± 3,88a 95,33 ± 5,06a 50 nCu 66,41 ± 2,55c 91,45 ± 3,50b 96,71 ± 4,44a 50 nCu* 57,24 ± 2,09b 90,34 ± 3,00b 97,24 ± 3,96b 0,05 nCo 50,00 ± 2,35b 80,41 ± 3,45a 95,36 ± 4,42a 0,5 nCo 40,00 ± 2,77a 79,80 ± 3,76a 92,17 ± 4,94a 2,5 nCo 40,79 ± 2,84a 80,54 ± 3,98a 94,12 ± 4,82a 0,05 nCo* 46,36 ± 2,63b 88,77 ± 3,50b 95,36 ± 4,29a
Số liệu trong mỗi ơ thể hiện giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm ± sai số chuẩn; các chữ cái a,b,c trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lô đối chứng với các lơ thí nghiệm khác, p<0,0; ĐC: đối chứng, *: hạt nano thương mại.
Như vậy, các loại hạt nano sử dụng trong nghiên cứu đã có tác động tích cực đến phản ứng nảy mầm, thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt. Kết quả này cũng phù hợp với một số công bố trước đây. Cụ thể, Takahashi và cộng sự (2009) đã chỉ ra
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
rằng các thành phần khoáng chất Fe, Zn, Mn, và Cu là nhu cầu thiết yếu trong sự nảy mầm hạt gạo [50]. Nghiên cứu của Prasad và cộng sự (2012) đã cho thấy rằng, sử dụng hợp chất nano oxit kẽm (ZnO) xử lý với hạt đậu phộng trước khi gieo ở những liều lượng khác nhau, đã xác định ở liều lượng 1000 ppm (1000 mg/L) làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm, sức sống cây con và năng suất cao hơn 34% so với nghiệm thức xử lý ZnSO4 [42]. Ngo Quoc Buu và cộng sự (2014) cũng cho thấy, xử lý hạt giống đậu tương ĐT51 với nCo làm tăng tỷ lệ nảy mầm 25% so với đối chứng [38].
3.2. Ảnh hƣởng của hạt nano kim loại sự phát triển của rễ mầm đậu tƣơng
Rễ là một cấu trúc quan trọng cần thiết cho sự sống còn của thực vật. Đặc biệt trong giai đoạn nảy mầm, sự phát triển rễ mầm đảm bảo cho cây được tiếp xúc nhanh với môi trường đất, bắt đầu chủ động hấp thu nước và các chất dinh dưỡng từ đất để sinh trưởng và phát triển. Nhằm tìm hiểu tác động của hạt nano kim loại đến hình thái và sự phát triển rễ mầm, rễ mầm ở các lô xử lý nano và lô đối chứng được quan sát và đo đạc 3 tiếng/lần bắt đầu từ mốc 15 giờ cho đến 24 giờ sau khi xử lý. Kết quả phân tích hình thái và tốc độ phát triển rễ mầm đậu tương được thể hiện ở Hình 4 và Bảng 8.
Từ các kết quả thu được, có thể nhận thấy ở các lô hạt xử lý với các dung dịch nano kim loại ở các nồng độ khác nhau rễ mầm xuất hiện sớm và phát triển nhanh hơn lô đối chứng, ngoại trừ lô xử lý với nồng độ 25 mg/L nFe và 5 mg/L nCu. Tại mốc 15 giờ sau khi xử lý, chiều dài rễ mầm đạt 7,87 – 8,27 mm ở lô xử lý với nFe; 7,55 – 8,26 mm ở lô xử lý với nCu; 8,46 – 9,10 mm ở lô xử lý với nCo; 8,82 – 9,26 ở lô xử lý với nZnO; trong khi chiều dài rễ mầm ở lô đối chứng chỉ đạt 7,53 mm (Bảng 8). Trong số các hạt nano kim loại đã sử dụng, nZnO thể hiện tác động tốt nhất đến sự phát triển của rễ. Ở nồng độ nZnO thử nghiệm thấp nhất 25 mg/L, chiều dài rễ mầm đạt 8,82 mm dài hơn đáng kể so với đối chứng chỉ đạt 7,53 mm. Tốc độ tăng trưởng của rễ mầm có xu hướng nhanh hơn khi nồng độ nZnO tăng lên. Chiều dài rễ mầm đạt cao nhất (9,26 mm) ở nồng độ 500 mg/L nZnO. Ở nồng độ nCo thấp nhất được thử nghiệm (0,05 mg/L) cũng cho hiệu quả tương tự như nZnO. Hiệu quả này giảm khi nồng độ của nCo tăng lên đến 0,5
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
mg/L và 2,5 mg /L; tuy nhiên chiều dài rễ mầm vẫn đạt 8,46 - 8,52 mm và cao hơn so với đối chứng (Bảng 8). nFe và nCu chỉ làm tăng sự phát triển của rễ mầm ở nồng độ thử nghiệm là 50 mg/L và 250 mg/L nFe, 25 mg/L và 50 mg/L nCu.
Bảng 8. Ảnh hưởng của nFe, nCu, nZnO và nCo đến chiều dài rễ mầm đậu tương
Lơ thí nghiệm
(mg/L)
Chiều dài rễ mầm (mm)
15 giờ 18 giờ 21 giờ 24 giờ
ĐC 7,53 ± 0,21a 8,98 ± 0,23a 10,65 ± 0,24a 12,56 ± 0,33a 25 nFe 7,87 ± 0,21a 9,33 ± 0,38a 11,46 ± 0,22a 13,32 ± 0,37a 50 nFe 8,36 ± 0,39b 11,41 ± 0,57b 12,70 ± 0,84c 15,04 ± 0,27b 250 nFe 8,27 ± 0,40b 9,94 ± 0,69b 12,20 ± 0,91bc 14,97 ± 0,19b 25 nZnO 8,82 ± 0,35b 10,38 ± 0,64bc 12,50 ± 0,96b 15,11 ± 0,12b 50 nZnO 9,08 ± 0,63bc 10,96 ± 0,86c 12,84 ± 0,89bc 15,18 ± 0,14b 500 nZnO 9,26 ± 0,18c 10,81 ± 0,62c 13,06 ± 0,87c 15,51 ± 1,03c 5 nCu 7,55 ± 0,73a 8,94 ± 0,29a 10,66 ± 0,77a 12,43 ± 0,39a 25 nCu 8,30 ± 0,03b 10,24 ± 0,47bc 12,47 ± 0,86b 15,02 ± 0,42b 50 nCu 8,26 ± 0,39b 10,37 ± 0,68bc 13,07 ± 0,78c 15,79 ± 1,01c 0,05 nCo 9,10 ± 0,31c 9,34 ± 0,69b 11,12 ± 0,72a 13,54 ± 0,65a 0,5 nCo 8,46 ± 0,40b 8,90 ± 0,79a 10,14 ± 0,82a 12,55 ± 0,91a 2,5 nCo 8,52 ± 0,55b 9,12 ± 0,10a 11,12 ± 0,33a 13,21 ± 0,57a
Số liệu trong mỗi ô thể hiện giá trị trung bình của 30 mẫu ± sai số chuẩn; các chữ cái a,b,c trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lơ đối chứng (ĐC) với các lơ thí nghiệm khác, p<0,05.
Sau 18 giờ, tốc độ tăng trưởng của rễ mầm ở lô hạt được xử lý với nFe 50 mg/L là cao nhất so với các lô hạt xử lý với dung dịch nano khác, chiều dài rễ mầm trung bình đạt 11,41 mm (Bảng 8). Tiếp theo đó là lơ hạt được xử lý với nZnO (10,81 -10,96 mm). Ở thời điểm này, 25 mg/L và 50 mg/L nCu có tác động thúc đẩy rễ mầm phát triển nhanh hơn giai đoạn trước đó, chiều dài rễ mầm đạt 10,24-10,37 mm. Chiều dài trung bình của rễ mầm gần bằng với độ dài của rễ mầm ở lô được xử
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
lý với nZnO. Ngược lại, tốc độ tăng trưởng rễ mầm ở lô hạt được xử lý với nCo bị chậm lại, chiều dài rễ mầm chỉ đạt 9,34 mm.
Từ 21 đến 24 giờ, tốc độ tăng trưởng của rễ mầm dưới tác dụng của nFe, nZnO, nCu và nCo vẫn cao hơn so với đối chứng. Chiều dài rễ đạt 15,51 mm với 500 mg/L nZnO; 15,79 mm với 50 mg/L nCu; 15,04 mm với 50 mg/L nFe; 13,54 mm với 0,05 mg/L nCo; trong khi chiều dài rễ mầm ở lô đối chứng chỉ đạt 12,56 mm (Bảng 8).
Hình 4. Hình thái rễ mầm đậu tương ở các lơ thí nghiệm
Những kết quả trên cho thấy, các hạt nano kim loại sử dụng trong nghiên cứu, đặc biệt là nFe, nZnO và nCu có tác động thúc đẩy sự nảy mầm hạt đậu tương và phát triển của rễ mầm ít nhất trong vịng 24 giờ sau khi xử lý. Sự khác nhau về hình thái và tốc độ phát triển rễ mầm giữa các lô xử lý với hạt nano kim loại và lô đối chứng cũng được thể hiện rõ trong Hình 4. Như vậy, việc xử lý hạt giống với các dung dịch nano kim loại trước khi gieo đã mang lại những hiệu quả tích cực
A B
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
trong giai đoạn đầu của sự nảy mầm ở hạt đậu tương và sự phát triển của rễ mầm.
3.3. Ảnh hƣởng của hạt nano kim loại đến sự phát triển của chồi mầm đậu tƣơng tƣơng
Các thí nghiệm khảo sát cho thấy sự phát triển của chồi mầm bắt đầu chậm hơn so với rễ mầm. Do đó, thời điểm quan sát và phân tích sự phát triển của chồi mầm cũng được bắt đầu từ mốc 15 giờ, nhưng các chỉ tiêu hình thái của chồi mầm được quan sát, đánh giá 12 tiếng/lần và kéo dài đến 48 giờ kể từ khi hạt nảy mầm (mốc 63 giờ). Kết quả đánh giá hình thái và tốc độ phát triển chồi mầm của các lơ thí nghiệm được thể hiện ở Hình 5 và Bảng 9.
Bảng 9. Ảnh hưởng của nFe, nCu, nZnO và nCo đến chiều dài chồi mầm đậu tương
Lơ thí nghiệm
(mg/L)
Chiều dài chồi mầm (mm)
15 giờ 27 giờ 39 giờ 51 giờ 63 giờ
ĐC 1,03 ± 0,05a 1,13 ± 0,03a 1,71 ± 0,07a 2,08 ± 0,01a 3,21 ± 0,05a 25 nFe 1,09 ± 0,04 a 1,17 ± 0,04a 1,58 ± 0,09 a 2,08 ± 0,01a 3,52 ± 0,03 a 50 nFe 1,07 ± 0,03a 1,12 ± 0,04a 1,71 ± 0,10 a 2,08 ± 0,09a 3,19 ± 0,06a 250 nFe 1,10 ± 0,04 a 1,19 ± 0,05a 1,66 ± 0,07 a 2,11 ± 0,10a 3,58 ± 0,06a 25 nZnO 1,43 ± 0,04a 1,50 ± 0,05a 2,62 ± 0,09b 3,29 ± 0,10b 4,67 ± 0,06b 50 nZnO 1,39 ± 0,02a 1,49 ± 0,04a 2,73 ± 0,05b 3,13 ± 0,11b 4,44 ± 0,10b 500 nZnO 1,33 ± 0,04a 1,44 ± 0,04a 2,63 ± 0,07b 3,12 ± 0,09b 4,75 ± 0,11b 5 nCu 1,08 ± 0,06a 1,19 ± 0,08a 1,69 ± 0,14a 1,96 ± 0,02a 3,10 ± 0,12a 25 nCu 1,12 ± 0,05a 1,29 ± 0,09a 1,81 ± 0,15a 2,50 ± 0,05a 3,58 ± 0,13a 50 nCu 1,13 ± 0,07a 1,18 ± 0,09a 1,74 ± 0,11a 2,24 ± 0,12a 3,43 ± 0,07a 0,05 nCo 1,36 ± 0,03a 1,40 ± 0,04a 2,56 ± 0,08b 3,24 ± 0,09b 4,25 ± 0,14b 0,5 nCo 1,35 ± 0,04a 1,45 ± 0,05a 2,48 ± 0,05b 3,02 ± 0,08b 4,11 ± 0,13b 2,5 nCo 1,35 ± 0,03a 1,48 ± 0,04a 2,48 ± 0,06b 3,07 ± 0,06b 4,05 ± 0,09b
Số liệu trong mỗi ô thể hiện giá trị trung bình của 30 mẫu ± sai số chuẩn; các chữ cái a,b trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lơ đối chứng (ĐC) với các lơ thí nghiệm khác, p<0,05.
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
Kết quả ở Bảng 9 cho thấy, ở mốc 15 giờ và 27 giờ chiều dài chồi mầm ở các lô hạt được xử lý với dung dịch nano khơng có sự khác biệt đáng kể so với đối chứng. Từ 39 giờ trở đi, chồi mầm ở lô được xử lý với nZnO và nCo tăng đáng kể và phát triển nhanh hơn so với đối chứng. Chiều dài chồi mầm của 2 lô này đạt được khoảng 3,0 mm ở mốc 51 giờ và 4,0 mm ở mốc 63 giờ, trong khi lô đối chứng là 2,0 và 3,0 mm ở các mốc tương ứng. nFe và nCu không ảnh hưởng đến sự phát