Ký hiệu mẫu DNA
Thông tin mẫu thực vật Hàm lƣợng Cytidine (mg/g) Hàm lƣợng 5-methylcytidine (mg/g) Mức độ methyl hóa DNA (%) 48.1 ĐC 53,458 0,726 1,340 48.2 50 mg/L nFe 36,968 0,498 1,329 48.3 50 mg/L nFe* 30,086 0,463 1,516 48.4 50 mg/L nCu 64,225 0,977 1,498 48.5 50 mg/L nCu* 20,486 0,194 0,938 48.6 50 mg/L ZnO 20,166 0,210 1,031 48.7 0,05 mg/L nCo 24,717 0,324 1,294 48.8 0,05 mg/L nCo* 30,459 0,315 1,024
ĐC: đối chứng không xử lý nano; *: hạt nano thương mại (Mỹ)
Như vậy, tỷ lệ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 48 giờ được xử lý nano kim loại đều biến động khác nhau và khác so với mẫu đối chứng. Có 4 mẫu xử lý nano là nCu*, nZnO, nCo và nCo* có tỷ lệ methyl hóa thấp hơn so với ở mẫu đối chứng khơng xử lý nano kim loại (1,34%). Trong đó, mẫu có tỷ lệ methyl hóa thấp nhất là nano Cu* (0,938%).
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
và một số trường hợp hiếm m6A (N6 methyl adenine) trong ty thể. Sự methyl hóa ở thực vật được kiểm soát bởi các hormone và những thay đổi trong quá trình nảy mầm, ra hoa và chịu ảnh hưởng của các mầm bệnh như virut, vi khuẩn, nấm. Methyl hóa DNA có vai trị kiểm sốt sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng, đặc biệt liên quan đến việc điều hòa sự biểu hiện gen và sao chép DNA [57]. Sự methyl hóa trong các vùng DNA điều khiển có vai trị ngăn cản q trình phiên mã của các gen tương ứng dẫn đến các gen này không được biểu hiện. Do vậy, quá trình biểu hiện gen thường tỷ lệ nghịch với tỷ lệ methyl hóa của DNA trong tế bào. Tỷ lệ methyl hóa tương ứng với độ đóng mở (độ hoạt động) của gen. Thơng thường, gen được kích hoạt và biểu hiện khi vùng điều khiển của gen đó được giải methyl hóa (demethylation) theo cơ chế hoạt hóa của tế bào dựa trên các tín hiệu ngoại bào và hormone sinh trưởng. Vì thế, có thể giải thích hiện tượng giảm mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm của lơ xử lý nano so với mẫu đối chứng là do sự tăng cường biểu hiện của một số gen liên quan tới q trình phát triển rễ mầm.
Ngồi các mẫu xử lý nano có tỷ lệ methyl hóa cao hơn so với mẫu đối chứng, hai mẫu rễ mầm ở lô xử lý nano nFe* và nCu lại dẫn tới tăng tỷ lệ methyl hóa so với mẫu đối chứng (Bảng 14). Điều này cũng có thể giải thích do tác động của hạt nano kim loại dẫn tới giảm sự biểu hiện hoặc ức chế một số gen.
Khi so sánh mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 18 giờ và 48 giờ đối với từng lô xử lý hạt nano kim loại (Bảng 13 và Bảng 14), có thể nhận mẫu xử lý nFe* có tỷ lệ methyl hóa thấp hơn của đối chứng ở giai đoạn rễ 18 giờ nhưng lại cao hơn so với đối chứng ở giai đoạn 48 giờ. Ngược lại với mẫu xử lý nCu*, nZnO và mẫu nCo*, ở giai đoạn 18 giờ, tỷ lệ methyl hóa cao hơn nhiều so với đối chứng nhưng ở giai đoạn 48 giờ lại thấp hơn so với đối chứng.
Như vậy ảnh hưởng của các hạt nano kim loại lên quá trình nảy mầm rất phức tạp, cần tiếp tục nghiên cứu sự biểu hiện của từng nhóm gen, từng gen riêng biệt và ở các giai đoạn phát triển khác nhau để làm rõ cơ chế tác động của từng loại hạt nano đối với sự biểu hiện gen
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận 3.6. Ảnh hƣởng của hạt nano kim loại đến sự biểu hiện của một số gen liên
quan đến quá trình nảy mầm của hạt đậu tƣơng
3.6.1. Tách chiết RNA tổng số
Tách chiết RNA tổng số là khâu đầu tiên trong các bước phân tích mức độ biểu hiện gen ở các mẫu nghiên cứu. RNA tổng số của 8 mẫu rễ mầm 18 giờ ký hiệu từ 18.1 đến 18.8 tương ứng với các lô xử lý (Bảng 15) và 8 mẫu rễ mầm 48 giờ ký hiệu từ 48.1 đến 48.8 tương ứng với các lô xử lý (Bảng 16) được tách chiết bằng phương pháp Trizol. Sau khi tách chiết, 5µl mẫu được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Kết quả ở Hình 8 cho thấy, ở tất cả các mẫu tách chiết đều xuất hiện 2 băng rRNA (18S và 26S) rõ nét. Như vậy, đã tách được RNA tổng số từ các mẫu rễ mầm đậu tương 18 giờ và 48 giờ.
Hình 8. Ảnh điện di RNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 giờ (A) và 48 giờ (B) sau xử lý hạt.(Các mẫu ký hiệu theo bảng 15 và bảng 16)
Để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn DNA, các mẫu RNA tổng số sẽ được làm sạch với DNase. Sau khi làm sạch, mẫu RNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương 18 giờ và 48 giờ được đo nồng độ và xác định các chỉ số liên quan đến độ tinh sạch (A260/280, A260/230) bằng máy Nanodrop. Trong đó, chỉ số A260/230 xác định sự có mặt của carbohydrate và hợp chất chứa nhóm phenol; chỉ số A260/280 xác định sự có mặt của protein. RNA được cho là “sạch” nếu chỉ số A260/280 nằm trong
Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
khoảng 1,8 – 2,1 và A260/230 đạt tối ưu là 2,0. Kết quả đo quang phổ của các mẫu RNA tổng số tách từ mẫu rễ mầm đậu tương 18 giờ (Bảng 15) và 48 giờ (Bảng 16) cho thấy, tất cả các mẫu đều có nồng độ cao dao động từ 718 – 982 ng/µl, đồng thời các chỉ số A260/280 và A260/230 cũng nằm trong mức cho phép. Như vậy, RNA tổng số của các mẫu rễ mầm 18 giờ và 48 giờ đảm bảo đủ chất lượng để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.