CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp phân tích sinh học phân tử cây chuyển gen
2.2.5.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ lá ngô
Tiến hành thu mẫu lá khi cây ngô đƣợc 4 lá để tách chiết ADN tổng số. ADN đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến.
Dung dịch đệm chiết CTAB có thành phần nhƣ sau:
Dung dịch mẹ Lƣợng cần lấy cho 100 ml Nồng độ cuối cùng (100 ml)
CTAB 2g 2%
PVP 2g 2%
1 M Tris-HCl (pH 8) 10ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8)
5 M NaCl 28 ml 1,4 M NaCl
1M EDTA (pH 8) 1 ml 10 mM EDTA (pH 8)
Mercaptoethanol 100ul 0,2%
- Nghiền khoảng 1 g mẫu lá thành bột mịn trong N2 lỏng, chuyển sang eppendorf 1,5 ml.
- Thêm 800ul đệm CTAB vào ống đựng mẫu, vortex đến khi mẫu hòa đều trong dịch đệm. Ủ ở 65oC ít nhất 1h.
- Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 v/p thu dịch nổi sau đó hút lớp dịch nổi sang ống mới
- Thêm thể tích tƣơng đƣơng Phenol/Chloroform/isoamylalcohol (25 : 24 : 1) . Votex trong 10 -15 phút. Ly tâm 10 – 15 phút 12.000 – 13.000 v/p ở 40C thu dịch nổi
- Thêm thể tích tƣơng đƣơng 24 : 1 (Chloroform/isoamylalcohol). Votex trong 10 phút. Ly tâm 15 phút ở 12.000 – 13.000 v/p thu lớp dịch lỏng phía trên
- Thêm thể tích tƣơng đƣơng isopropanol và ủ qua đêm ở -20oC để thu đƣợc lƣợng kết tủa lớn nhất.
- Ly tâm thu tủa và rửa sạch bằng cồn 75o ít nhất 2 lần. - Thổi khơ ADN đã rửa sạch và hịa tan bằng TE.
- Bổ sung 20 mg/l ARNase. Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1- 2h
2.2.5.2. Phân tích PCR các cây ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ
Các cây chuyển gen đƣợc sàng lọc bằng phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen EPSPS trong hệ gen thực vật. Chúng tôi tiến hành các phản ứng PCR ở thể tích phản ứng 20 l, sử dụng Taq DNA polymerase (Thermo) với 35 chu kỳ. Thành phần, nồng độ các chất tham gia phản ứng PCR theo bảng 2.3.
Để nhân gen EPSPS chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen có trình tự đƣợc trình bày trong bảng 2.3; chƣơng trình phản ứng với cặp mồi CP4-EPSPS là 95oC – 3 phút, 95oC – 1 phút, 57,5oC – 30 giây, 72oC – 1phút. Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại trong 35 chu kỳ, 72oC – 10 phút, kết thúc 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc điện di
trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100 mV và nhuộm bằng ethidium bromide để quan sát các vạch ADN.
Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR
TT Đoạn mồi Trình tự mồi
1 CP4-EPSPS-F 5’- ATGGC ACAAA TTAAC AACAT GGCAC-3’
CP4-EPSPS-R 5’- GCCCA TTTCG CGCAG CGGGT TCAAC -3’
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) Buffer+KCl-MgCl2 2 MgCl2 (25mM) 1.6 dNTP (2mM) 2 Primer CP4-EPSPS - F (10pM) 0.5 Primer CP4-EPSPS- R (10pM) 0.5 Taq polymerase 0.2 ADN 1 H20 12.2 Tổng phản ứng 20
Phân tích Southern blot
Phân tích Southern blot đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp lai không đồng vị phóng xạ, đánh giá số bản copy của gene sử dụng Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche).
30 ADN tổng số tách từ các cây ngô chuyển gen có kết quả dƣơng tính với PCR đƣợc xử lý với enzym BamHI, phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2%, thời gian 3-4h ở hiệu điện thế 80V, sau đó tiến hành nhuộm với EtBr (Ethidium bromide) 0,002%, sử dụng DIG-labelled Marker II làm thang DNA chuẩn
Đặt gel trong HCl 0.2M trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa lại bằng nƣớc cất 2-3 lần, sau đó biến tính gel trong 1,5M NaCl + 0,1M NaOH 2 lần, mỗi lần 15 phút.
Rửa lại bằng nƣớc cất từ 2-3 lần, tiếp tục đặt gel vào trong dung dịch trung tính trong 15 phút.
Chuyển gel lên màng sử dụng dung dịch 20X SSC.
Cố định DNA lên màng lai bằng UV-cross linking trong thời gian 15 phút.
Tiến hành các bƣớc tiền lai, lai và phát hiện sản phẩm lai theo quy trình của Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche).
Phương pháp xác định sự có mặt của protein EPSPS
Đối với các cây chuyển gen có kết quả Southern blot dƣơng tính, chúng tơi tiến hành xác định sự có mặt của protein EPSPS bằng phƣơng pháp que thử sử dụng Kit EnviroLogix QuickStixTM(Agdia, USA)