2.1.2. Hố chất và thiết bị máy móc
Các vật tƣ hóa chất, máy li tâm các loại, thiết bị điện di ADN, tủ nuôi ổn nhiệt, máy nhân gen và các trang thiết bị khác của phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.1.3. Địa điểm thực hiện
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp và Trạm thực nghiệm Văn Giang, Hƣng Yên.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Các thí nghiệm biến nạp gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS vào phôi hợp tử
chƣa trƣởng thành thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc tiến hành theo quy trình của Phạm Thị Lý Thu (2007) [9] và Zhao và cộng sự, 2001 [61] có cải tiến gồm các bƣớc nhƣ mô tả dƣới đây:
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn
Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glycerol ở -80oC lên đĩa môi trƣờng mơi trƣờng YEB đặc có bổ sung 50 mg/l kanamycin, ni ở 280C trong 2-3 ngày. Trƣớc khi biến nạp, hịa tan vi khuẩn trong mơi trƣờng lây nhiễm tới OD550 0,3- 0,4; nuôi lắc 100 v/p trong thời gian 3 – 4 h, bổ sung 200 mg/l AS. Dịch huyền phù vi khuẩn này đƣợc sử dụng để lây nhiễm với phôi.
Khử trùng bắp
Bắp non đƣợc thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà lƣới chống cơn trùng. Bóc bỏ các lớp bao bi bên ngồi sau đó khử trùng bắp trong dung dịch nƣớc javen (NaClO) 30% với một vài giọt Tween-20 trong 20 phút sau đó rửa lại 5 lần bằng nƣớc cất khử trùng và để bắp dựng đứng trên đĩa Petri cỡ 10cm đã khử trùng (Hình 2.3)
Lây nhiễm vi khuẩn với phôi ngô non
Ngay sau khi khử trùng bắp, phôi non đƣợc tách trong điều kiện vơ trùng. Phơi non sau đó đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 30 - 60 phút
Hình 2.3. Tách phơi từ bắp ngơ dịng CM8 (Vụ Hè Thu, 8 ngày sau thụ phấn)
Giai đoạn đồng nuôi cấy
Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn đƣợc chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy (CCM), nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 20oC, thời gian 3 ngày.
Nuôi phục hồi
Sau giai đoạn đồng nuôi cấy, chuyển phôi đã biến nạp từ môi trƣờng CCM sang môi trƣờng phục hồi (ReM) có chứa kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime (250 mg/l), nuôi trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 28oC, thời gian 7 ngày.
Chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Mô sẹo tạo thành từ phôi non đã biến nạp trên môi trƣờng ReM đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng chọn lọc (EcM) (có bổ sung 100 mg/l Kanamycin), ni trong tối ở 28oC, thời gian 15 ngày.
Tạo chồi chuyển gen
Mơ sẹo phơi hố tạo thành trên mơi trƣờng chọn lọc EcM đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh chồi (SeM) để tái sinh chồi, nuôi ở điều kiện chiếu sáng ở 28oC, thời gian 15 - 20 ngày.
Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh
Chồi tái sinh trong môi trƣờng chọn lọc SeM khi đạt đƣợc chiều cao 2 – 3cm đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tạo cây hồn chỉnh RM, ni trong điều kiện chiếu sáng với chu kỳ chiếu sáng 16:8 h sáng: tối, ở nhiệt độ 25oC, thời gian 10-20 ngày.
Đưa cây ra đất
Cây tái sinh hoàn chỉnh sẽ đƣợc chuyển ra trồng trong túi bầu có chứa giá thể TN.1 (Viện Thổ Nhƣỡng Nơng Hóa); sau khi cây xuất hiện lá mới thì chuyển sang trồng trên luống đất trong nhà lƣới cách ly côn trùng.
Bảng 2.1. Công thức môi trƣờng
Môi trƣờng Thành phần
YEB 10g/l peptone + 10 g/l yeast extract + 5g/l NaCl+ 12g/l agar; pH 7.0 IM - AS N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 68,5 g/l sucrose + 36 g/l
glucose + 0,7 g/l L-proline + 1,5 mg/l 2,4D; pH 5,2; 200 mg/l AS. CCM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L-
proline + 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 200 mg/l AS; 0,85 mg/l AgNO3.
ReM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L- proline + 0,5 g/l MES + 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 0,85 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim.
EcM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L- proline + 0,5 g/l MES+ 1,5 mg/l 2,4D; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 10 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim; 100 mg/l kanamycine
SeM N6 (Chu & CS., 1975) + 2 mg/l glycine + 30 g/l sucrose + 0,7 g/l L- proline + 0,5 g/l MES; 6 g/l gellan-gum; pH 5,8; 1 mg/l BAP; 0,85 mg/l AgNO3; 250 mg/l cefotaxim; 100 mg/l kanamycine
RM MS (Murashige & Skoog, 1962) + 60 g/l sucrose + 100 mg/l myo-
inositol; 9 g/l agar; pH 5,8
2.2.2. Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lưới kiện nhà lưới
Các dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ đƣợc xác định hoạt tính của gen chuyển EPSPS bằng cách đánh giá tác động của thuốc trừ cỏ glyphosate lên lá của các cây chuyển gen và các cây khơng đƣợc chuyển gen. Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng thuốc trừ cỏ Vifosate (Sygenta) có chứa glyphosate ở các
nồng độ khác nhau bôi lên lá của các cây chuyển gen và các cây đối chứng khi cây ở giai đoạn 5 lá. Dùng bút lông thấm các dung dịch glyphosate đƣợc pha theo nồng độ 200 mg/l; 400 mg/l; 600 mg/l và 1200 mg/l với 0,1 % Tween X - 100 để bôi lên mặt trên của lá. Quan sát và đánh giá phản ứng của mô tế bào lá tại vùng bôi thuốc trừ cỏ sau 10 ngày.
2.2.3. Thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen trong điều kiện nhà lưới nhà lưới
Các dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ sau khi tái sinh đã đƣợc chuyển ra đất trồng. Khi cây ở giai đoạn có 5 – 6 lá, tiến hành thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ bằng cách phun dung dịch Vifosate có chứa glyphosate 200 mg/l và 0,1% Tween 20 (v/v) đối với các cây chuyển gen EPSPS. Phun đều lên lá của các cây đã đƣợc chuyển gen và cây không đƣợc chuyển gen (đối chứng), 2 ngày phun 1 lần, phun 3 lần
Quan sát và theo dõi mức độ kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen và đối chứng (cây bình thƣờng khơng đƣợc chuyển gen) sau 10 ngày phun.
2.2.4. Thí nghiệm nảy mầm của hạt ngơ thế hệ T0
Hạt đƣợc khử trùng bề mặt bằng ethanol 70% trong thời gian 2 phút (20 hạt/ 100ml ethanol), sau đó cho hạt vào bình chứa 0,1% HgCl2, lắc đều 15 phút. Rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng 6 lần. Sau đó cho hạt nảy mầm trên mơi trƣờng MS có bổ sung 200 mg/l glyphosate
2.2.5. Phương pháp phân tích sinh học phân tử cây chuyển gen
2.2.5.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ lá ngô
Tiến hành thu mẫu lá khi cây ngô đƣợc 4 lá để tách chiết ADN tổng số. ADN đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến.
Dung dịch đệm chiết CTAB có thành phần nhƣ sau:
Dung dịch mẹ Lƣợng cần lấy cho 100 ml Nồng độ cuối cùng (100 ml)
CTAB 2g 2%
PVP 2g 2%
1 M Tris-HCl (pH 8) 10ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8)
5 M NaCl 28 ml 1,4 M NaCl
1M EDTA (pH 8) 1 ml 10 mM EDTA (pH 8)
Mercaptoethanol 100ul 0,2%
- Nghiền khoảng 1 g mẫu lá thành bột mịn trong N2 lỏng, chuyển sang eppendorf 1,5 ml.
- Thêm 800ul đệm CTAB vào ống đựng mẫu, vortex đến khi mẫu hòa đều trong dịch đệm. Ủ ở 65oC ít nhất 1h.
- Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 v/p thu dịch nổi sau đó hút lớp dịch nổi sang ống mới
- Thêm thể tích tƣơng đƣơng Phenol/Chloroform/isoamylalcohol (25 : 24 : 1) . Votex trong 10 -15 phút. Ly tâm 10 – 15 phút 12.000 – 13.000 v/p ở 40C thu dịch nổi
- Thêm thể tích tƣơng đƣơng 24 : 1 (Chloroform/isoamylalcohol). Votex trong 10 phút. Ly tâm 15 phút ở 12.000 – 13.000 v/p thu lớp dịch lỏng phía trên
- Thêm thể tích tƣơng đƣơng isopropanol và ủ qua đêm ở -20oC để thu đƣợc lƣợng kết tủa lớn nhất.
- Ly tâm thu tủa và rửa sạch bằng cồn 75o ít nhất 2 lần. - Thổi khô ADN đã rửa sạch và hòa tan bằng TE.
- Bổ sung 20 mg/l ARNase. Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1- 2h
2.2.5.2. Phân tích PCR các cây ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ
Các cây chuyển gen đƣợc sàng lọc bằng phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen EPSPS trong hệ gen thực vật. Chúng tơi tiến hành các phản ứng PCR ở thể tích phản ứng 20 l, sử dụng Taq DNA polymerase (Thermo) với 35 chu kỳ. Thành phần, nồng độ các chất tham gia phản ứng PCR theo bảng 2.3.
Để nhân gen EPSPS chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen có trình tự đƣợc trình bày trong bảng 2.3; chƣơng trình phản ứng với cặp mồi CP4-EPSPS là 95oC – 3 phút, 95oC – 1 phút, 57,5oC – 30 giây, 72oC – 1phút. Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại trong 35 chu kỳ, 72oC – 10 phút, kết thúc 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc điện di
trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100 mV và nhuộm bằng ethidium bromide để quan sát các vạch ADN.
Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR
TT Đoạn mồi Trình tự mồi
1 CP4-EPSPS-F 5’- ATGGC ACAAA TTAAC AACAT GGCAC-3’
CP4-EPSPS-R 5’- GCCCA TTTCG CGCAG CGGGT TCAAC -3’
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) Buffer+KCl-MgCl2 2 MgCl2 (25mM) 1.6 dNTP (2mM) 2 Primer CP4-EPSPS - F (10pM) 0.5 Primer CP4-EPSPS- R (10pM) 0.5 Taq polymerase 0.2 ADN 1 H20 12.2 Tổng phản ứng 20
Phân tích Southern blot
Phân tích Southern blot đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp lai khơng đồng vị phóng xạ, đánh giá số bản copy của gene sử dụng Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche).
30 ADN tổng số tách từ các cây ngơ chuyển gen có kết quả dƣơng tính với PCR đƣợc xử lý với enzym BamHI, phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2%, thời gian 3-4h ở hiệu điện thế 80V, sau đó tiến hành nhuộm với EtBr (Ethidium bromide) 0,002%, sử dụng DIG-labelled Marker II làm thang DNA chuẩn
Đặt gel trong HCl 0.2M trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa lại bằng nƣớc cất 2-3 lần, sau đó biến tính gel trong 1,5M NaCl + 0,1M NaOH 2 lần, mỗi lần 15 phút.
Rửa lại bằng nƣớc cất từ 2-3 lần, tiếp tục đặt gel vào trong dung dịch trung tính trong 15 phút.
Chuyển gel lên màng sử dụng dung dịch 20X SSC.
Cố định DNA lên màng lai bằng UV-cross linking trong thời gian 15 phút.
Tiến hành các bƣớc tiền lai, lai và phát hiện sản phẩm lai theo quy trình của Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche).
Phương pháp xác định sự có mặt của protein EPSPS
Đối với các cây chuyển gen có kết quả Southern blot dƣơng tính, chúng tơi tiến hành xác định sự có mặt của protein EPSPS bằng phƣơng pháp que thử sử dụng Kit EnviroLogix QuickStixTM(Agdia, USA)
2.2.6. Phương pháp thu thập số liệu thống kê
Các phôi non đƣợc cấy với mật độ 25 phôi/đĩa Petri 7,5 cm.
Cứ 2-3 tuần sau khi các phôi non hoặc mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng ECM/SM, mô sẹo phơi hố tạo thành và cây tái sinh đƣợc đếm.
Các thông số sau đƣợc quan tâm để đánh giá hiệu quả của q trình ni cấy: Tỷ lệ phục hồi của phôi ngơ sau biến nạp (%) = Số phơi sống sót sau chuyển
gen*100%/Tổng số phôi biến nạp.
Tỷ lệ tạo mô sẹo chuyển gene (%) = Số mô sẹo chuyển gene tạo thành*100%/Tổng số phôi phục hồi sau biến nạp.
Tỷ lệ tái sinh cây chuyển gene (%) = Số cây chuyển gene tái sinh*100%/Tổng số mô sẹo chuyển gene
Tỷ lệ sống sót của cây chuyển gene (%) = Số cây chuyển gene sống sót*100%/Tổng số cây chuyển gene ra đất.
Hiệu suất biến nạp (%) = Số cây mang gene chuyển*100%/Tổng số phôi biến nạp
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen CP4 EPSPS của các dịng ngơ
Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho đến nay đã áp dụng đƣợc đối với một số dịng/giống có khả năng tái sinh in vitro tốt. Đối với cây ngô, phôi hợp tử chƣa trƣởng thành (phơi non) là nguồn vật liệu thích hợp nhất cho chuyển gen bằng cả phƣơng pháp bắn gen và thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Tuy nhiên, sử dụng mơ đích là phơi non thì q trình biến nạp sẽ
chịu ảnh hƣởng nhiều bởi các yếu tố mơi trƣờng. Đó là, sự sinh trƣởng của cây ngơ mẹ cho vật liệu phôi trong các thời vụ trồng khác nhau trong năm sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng phôi. Trong nghiên cứu đánh giá về những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen, tác giả Phạm Thị Lý Thu đã chỉ ra kích thƣớc phơi ngơ phù hợp cho thí nghiệm chuyển gen là từ 1,0 – 1,2 mm (Phạm Thị Lý Thu, 2007) [9]. Trên thực tế, xác định thời gian sau thụ phấn để thu đƣợc kích thƣớc phơi phù hợp cho các thí nghiệm biến nạp gen phụ thuộc vào hai yếu tố giống ngô và thời vụ trồng. Chúng tôi đã tiến hành trồng các dịng ngơ thí nghiệm trong vụ Đơng xuân (11/2012- 2/2013) và vụ hè thu (8/2013 – 10/2013) tại nhà lƣới cách ly côn trùng ở Văn Giang, Hƣng Yên. Kết quả theo dõi và kiểm tra mẫu tại nhà lƣới cho thấy kích thƣớc phơi tách từ các bắp ngô sau khi thụ phấn trong hai vụ trồng rất khác biệt. Hơn nữa, giữa các dịng ngơ khác nhau kích thƣớc phơi cũng khác nhau với các bắp cùng thụ phấn tại một thời điểm. Để đạt đƣợc kích thƣớc phơi 1,0 – 1,2 mm làm vật liệu cho chuyển gen, bắp của các dịng ngơ thí nghiệm trồng trong vụ Hè Thu sẽ đƣợc thu vào thời điểm 8 – 12 ngày và trong vụ Đông Xuân là 12 – 15 ngày sau thụ phấn. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dịng ngơ CM8, VH1, CH9 ở hai vụ trồng Hè Thu và Đông Xuân đƣợc đánh giá thơng qua các thí nghiệm dƣới đây:
a, Vụ Đông Xuân 2012 – 2013
Trong vụ Đông Xuân 2012 – 2013, chúng tơi thực hiện 9 thí nghiệm chuyển gen
EPSPS vào 2 dịng ngơ chọn lọc (VH1, CM8) và 1 dịng ngơ lai CH9 (dịng lai F1
giữa dịng ngơ chọn lọc CM8 với dịng mơ hình HR9). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày tại bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dịng ngơ vụ Đơng Xn TT Dịng TT Dịng Số lƣợng mẫu TL tạo mơ sẹo TL tái sinh chồi Số cây ra đất Số cây sống sót
CCM REM ECM SEM RM
1 VH1 1467 1211 635 396 65 52,44 62,36 23 11
2 CM8 1378 1059 656 523 82 61,95 79,73 38 19
3 CH9 1152 810 404 136 42 49,88 33,66 12 5
Tổng số 3997 3080 1695 1055 189 73 35
Tổng số 9 thí nghiệm với 3997 phơi của 3 dịng ngơ đã đƣợc sử dụng làm vật liệu biến nạp. Kết quả thu đƣợc 73 cây đƣợc đƣa ra đất, trong số đó chỉ có 35 cây sống sót
Kết quả thí nghiệm cho thấy các dịng ngơ cho hiệu quả tiếp nhận gen rất khác nhau. Khả năng tiếp nhận gen ngoại lai của các dịng ngơ thí nghiệm đƣợc biểu hiện thơng qua tỉ lệ tạo mơ sẹo phơi hóa trên mơi trƣờng chọn lọc của phôi non sau chuyển gen. Trong 3 dịng ngơ nghiên cứu cho thấy dịng ngơ CM8 có tỉ lệ tạo mơ sẹo (61,95%) cao hơn so với hai dịng VH1 và CH9. Dịng CH9 cho tỉ lệ tạo mơ sẹo thấp nhất 49,88%
Xét về tỷ lệ tái sinh chồi của 3 dịng ngơ chuyển gen cho thấy: dịng ngơ CM8 cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 79,73%. Dịng CH9 có tỷ lệ tạo mơ sẹo thấp nhất cũng cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất đạt 33,66%, trong khi đó dịng VH1 đạt 62,36%
Đánh giá khả năng sống sót của cây chuyển gen tái sinh khi đƣa ra bầu đất, chúng tôi đã nhận đƣợc số cây chuyển gen tái sinh nhiều nhất (19 cây) ở dịng CM8 và ít nhất (5 cây) ở dịng CH9. Trong khi đó, dịng VH1 thu đƣợc 11 cây. Các cây