Thành phần Thể tích (µl) Buffer+KCl-MgCl2 2 MgCl2 (25mM) 1.6 dNTP (2mM) 2 Primer CP4-EPSPS - F (10pM) 0.5 Primer CP4-EPSPS- R (10pM) 0.5 Taq polymerase 0.2 ADN 1 H20 12.2 Tổng phản ứng 20
Phân tích Southern blot
Phân tích Southern blot đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp lai khơng đồng vị phóng xạ, đánh giá số bản copy của gene sử dụng Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche).
30 ADN tổng số tách từ các cây ngơ chuyển gen có kết quả dƣơng tính với PCR đƣợc xử lý với enzym BamHI, phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2%, thời gian 3-4h ở hiệu điện thế 80V, sau đó tiến hành nhuộm với EtBr (Ethidium bromide) 0,002%, sử dụng DIG-labelled Marker II làm thang DNA chuẩn
Đặt gel trong HCl 0.2M trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa lại bằng nƣớc cất 2-3 lần, sau đó biến tính gel trong 1,5M NaCl + 0,1M NaOH 2 lần, mỗi lần 15 phút.
Rửa lại bằng nƣớc cất từ 2-3 lần, tiếp tục đặt gel vào trong dung dịch trung tính trong 15 phút.
Chuyển gel lên màng sử dụng dung dịch 20X SSC.
Cố định DNA lên màng lai bằng UV-cross linking trong thời gian 15 phút.
Tiến hành các bƣớc tiền lai, lai và phát hiện sản phẩm lai theo quy trình của Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche).
Phương pháp xác định sự có mặt của protein EPSPS
Đối với các cây chuyển gen có kết quả Southern blot dƣơng tính, chúng tơi tiến hành xác định sự có mặt của protein EPSPS bằng phƣơng pháp que thử sử dụng Kit EnviroLogix QuickStixTM(Agdia, USA)
2.2.6. Phương pháp thu thập số liệu thống kê
Các phôi non đƣợc cấy với mật độ 25 phôi/đĩa Petri 7,5 cm.
Cứ 2-3 tuần sau khi các phôi non hoặc mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng ECM/SM, mô sẹo phơi hố tạo thành và cây tái sinh đƣợc đếm.
Các thông số sau đƣợc quan tâm để đánh giá hiệu quả của q trình ni cấy: Tỷ lệ phục hồi của phôi ngô sau biến nạp (%) = Số phơi sống sót sau chuyển
gen*100%/Tổng số phơi biến nạp.
Tỷ lệ tạo mô sẹo chuyển gene (%) = Số mô sẹo chuyển gene tạo thành*100%/Tổng số phôi phục hồi sau biến nạp.
Tỷ lệ tái sinh cây chuyển gene (%) = Số cây chuyển gene tái sinh*100%/Tổng số mô sẹo chuyển gene
Tỷ lệ sống sót của cây chuyển gene (%) = Số cây chuyển gene sống sót*100%/Tổng số cây chuyển gene ra đất.
Hiệu suất biến nạp (%) = Số cây mang gene chuyển*100%/Tổng số phôi biến nạp
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen CP4 EPSPS của các dịng ngơ
Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho đến nay đã áp dụng đƣợc đối với một số dịng/giống có khả năng tái sinh in vitro tốt. Đối với cây ngô, phôi hợp tử chƣa trƣởng thành (phôi non) là nguồn vật liệu thích hợp nhất cho chuyển gen bằng cả phƣơng pháp bắn gen và thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Tuy nhiên, sử dụng mơ đích là phơi non thì quá trình biến nạp sẽ
chịu ảnh hƣởng nhiều bởi các yếu tố mơi trƣờng. Đó là, sự sinh trƣởng của cây ngơ mẹ cho vật liệu phôi trong các thời vụ trồng khác nhau trong năm sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng phôi. Trong nghiên cứu đánh giá về những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen, tác giả Phạm Thị Lý Thu đã chỉ ra kích thƣớc phơi ngơ phù hợp cho thí nghiệm chuyển gen là từ 1,0 – 1,2 mm (Phạm Thị Lý Thu, 2007) [9]. Trên thực tế, xác định thời gian sau thụ phấn để thu đƣợc kích thƣớc phơi phù hợp cho các thí nghiệm biến nạp gen phụ thuộc vào hai yếu tố giống ngô và thời vụ trồng. Chúng tôi đã tiến hành trồng các dịng ngơ thí nghiệm trong vụ Đơng xuân (11/2012- 2/2013) và vụ hè thu (8/2013 – 10/2013) tại nhà lƣới cách ly côn trùng ở Văn Giang, Hƣng Yên. Kết quả theo dõi và kiểm tra mẫu tại nhà lƣới cho thấy kích thƣớc phơi tách từ các bắp ngô sau khi thụ phấn trong hai vụ trồng rất khác biệt. Hơn nữa, giữa các dịng ngơ khác nhau kích thƣớc phơi cũng khác nhau với các bắp cùng thụ phấn tại một thời điểm. Để đạt đƣợc kích thƣớc phơi 1,0 – 1,2 mm làm vật liệu cho chuyển gen, bắp của các dịng ngơ thí nghiệm trồng trong vụ Hè Thu sẽ đƣợc thu vào thời điểm 8 – 12 ngày và trong vụ Đông Xuân là 12 – 15 ngày sau thụ phấn. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dịng ngơ CM8, VH1, CH9 ở hai vụ trồng Hè Thu và Đơng Xn đƣợc đánh giá thơng qua các thí nghiệm dƣới đây:
a, Vụ Đông Xuân 2012 – 2013
Trong vụ Đông Xuân 2012 – 2013, chúng tơi thực hiện 9 thí nghiệm chuyển gen
EPSPS vào 2 dịng ngơ chọn lọc (VH1, CM8) và 1 dịng ngơ lai CH9 (dịng lai F1
giữa dịng ngơ chọn lọc CM8 với dịng mơ hình HR9). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày tại bảng 3.1