Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS
1.3.3.3. Vector biểu hiện gen
Nhiều vector biểu hiện dành cho P. pastoris đã đƣợc thiết kế và đều có 5 yếu tố sau [25, 43]: (1) Promoter AOX1 (5’AOX1) là một đoạn trình tự có chiều dài gần 1 kb, cho phép protein đƣợc biểu hiện mạnh trong Pichia và định hƣớng plasmid tích hợp với hệ gen nấm men tại locus AOX1. Ngồi ra cịn có trình tự nằm sau trình tự kết thúc phiên mã ở đầu 3’ của gen aox1 cũng có tác dụng định hƣớng plasmid
tích hợp với hệ gen nấm men tại vị trí locus aox1.
(2) Một hoặc nhiều vị trí đa nối (MCS) cho phép chèn gen mong muốn vào vector biểu hiện.
(3) Trình tự kết thúc dịch mã có nguồn gốc từ gen aox1 của P. pastoris (TT) là trình tự dài khoảng 260 bp, cho phép kết thúc q trình dịch mã và sự thêm đi poly A ở mARN hiệu quả.
(4) Gen chỉ thị chọn lọc (his4) là một gen nguyên vẹn của Pichia mã hóa cho histidinol dehydrogenase, dài khoảng 2,4 kb và đƣợc sử dụng để bổ sung cho các chủng Pichia bị đột biến gen HIS4.
(5) Một trình tự cần thiết cho sự sao chép và tồn tại của plasmid trong vi khuẩn (Ampicillin và ColE1 origin). Amp là gen kháng ampicillin cho phép chọn lọc tế bào mang vector tái tổ hợp. ColE1 cho phép plasmid tái tổ hợp sao chép và tồn tại trong tế bào vi khuẩn.
Ngồi ra, vector biểu hiện cịn có trình tự chun biệt kích thích tiết protein tái tổ hợp ra môi trƣờng ni cấy nhƣ trình tự PHO1 của gen mã hóa cho
phosphatase trong P. pastoris hoặc trình tự của gen mã hóa cho nhân tố giới tính α (α factor prepro peptide) của S. cerevisiae đã đƣợc sử dụng thành công [15].
Để sử dụng promoter PAOX1 cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp, có 4 vector biểu hiện phổ biến là pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1 và pPIC9. Vector pHIL-D2 và
pPIC3.5 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein nội bào, còn pHIL-S1 và pPIC9 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tiết. Trong đó, vector pPIC9 đƣợc sử dụng rộng rãi để biểu hiện các protein.