Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Quy trình tách DNA plasmid
Nguyên lý
Tế bào vi khuẩn bị dung giải khi xử lý với dung dịch chứa SDS (sodium dodecyl sulfate) và NaOH. Trong đó, SDS sẽ làm biến tính protein phá vỡ màng tế bào, cịn NaOH sẽ làm biến tính DNA genome và DNA plasmid. Sau đó, hỗn hợp đƣợc trung hồ bằng potassium acetate (CH3COOK). Khi dung dịch đã đƣợc dung hồ thì DNA plasmid vịng, do có kích thƣớc nhỏ hơn rất nhiều so với DNA genome, sẽ đƣợc hồi tính nhanh chóng và hồ tan vào trong dung dịch. Ngƣợc lại, DNA genome và các protein khác bị kết tủa và “vƣớng” vào trong phức hợp SDS- kali, sau đó đƣợc loại bỏ bằng ly tâm [56].
Các bước thực hiện
Cấy chuyển một khuẩn lạc tế bào E. coli tái tổ hợp vào môi trƣờng LBA và ni lắc qua đêm ở 37oC. Sau đó hút dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi để thu tế bào.
Hồ tế bào thu đƣợc vào 100 µl với dung dịch I. Sau đó bổ sung thêm 200 µl dung dịch II, lắc đều rồi ủ trên đá 10 phút. Bổ sung tiếp 130 µl dung dịch III, lắc đều và để trên đá 15 phút. Sau đó bổ sung 450 - 500 µl dung dịch
chloroform/isoamylalcohol, trộn rồi ly tâm 15 phút, tốc độ 13000 vòng/phút để loại protein và DNA hệ gen.
Hút pha trên chuyển sang ống Eppendorf mới. DNA đƣợc tủa lại trong hai lần thể tích ethanol 100% trong 20 phút rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Làm khơ tủa, hồ tan DNA plasmid vào H2O sạch vô trùng và bảo quản plasmid tách đƣợc ở - 20oC. DNA plasmid sau khi tách đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose với nồng độ thích hợp.