Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS
1.3.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P pastoris
Cách đơn giản nhất để vector biểu hiện đƣợc tích hợp vào hệ gen P. pastoris là mở vòng vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế ở một vị trí đã đƣợc thiết kế sẵn trên gen đánh dấu his4 hoặc trên đoạn promoter AOX1. Khi vector mở vòng sẽ tạo
thành các đầu DNA và chính các đầu tận cùng DNA này sẽ kích thích sự tái tổ hợp tƣơng đồng dẫn đến sự trao đổi chéo đơn và tích hợp vector vào locus tƣơng đồng [13].
Hình 4 cho thấy sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris. Việc
tích hợp đƣợc thực hiện bằng sự trao đổi chéo đơn giữa gen his4 trên vector và
locus HIS4 của hệ gen P. pastoris nhờ sự mở vòng vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế (SalI hoặc StuI) cắt trình tự tƣơng ứng đã đƣợc thiết kế nằm trên gen his4.
Kết quả là promoter PAOX1 và gen mong muốn đƣợc tích hợp vào hệ gen của P. pastoris tại locus HIS4. Lúc này thể biến nạp có hiểu hình His+. Vì locus aox1 hoặc
Đầu 5’ promoter AOX1: nucleotide base 1-948 Vị trí mồi 5’ AOX1: nucleotide 855-875
Tín hiệu tiết (nhân tố α) (S): nucleotide 949-1218 Vị trí mồi α: nucleotide 1152-1172
Vùng đa nối: nucleotide 1192-1241
Vị trí mồi đầu 3’ AOX1: nucleotide 1327-1347 Đoạn kết thúc dịch mã 3’AOX1 (TT): nucleotide 1253-1586
Khung đọc mở (ORF) HIS4: nucleotide 4514-1980
Đoạn 3’ AOX1: nucleotide 4870-5626 ColE1 origin: bases 6708-6034
Gen kháng Ampicillin: nucleotide 713-6853
Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9
aox1:: ARG4 không liên quan đến sự tái tổ hợp này nên kiểu hình Mut+ của chủng sau khi tái tổ hợp xảy ra giống với kiểu hình trƣớc khi tái tổ hợp.
Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 [43] 1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris 1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris
Các protein sau khi đƣợc tổng hợp ra thƣờng trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã. Trong quá trình này, các protein đƣợc hoàn thiện về mặt cấu trúc, hình thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein. Các protein tạo ra sau quá trình chế biến có thể đƣợc giữ lại trong tế bào chất hoặc đƣợc tiết ra ngoài tế bào. Những protein đƣợc tiết ra ngoài tế bào gọi là protein ngoại bào. Quá trình tiết của protein ngoại bào địi hỏi phải có một trình tự tiết gồm các acid amin đặc biệt hay cịn gọi là tín hiệu dẫn ở đầu tận cùng N để giúp cho protein có thể đi qua màng tế bào. Tùy thuộc vào tín hiệu dẫn khác nhau mà protein có thể đƣợc vận chuyển đến các bào quan khác nhau hoặc đƣợc tiết khỏi tế bào. Ở P. pastoris, trình
tự tiết cho protein ngoại lai đã đƣợc sử dụng rất có hiệu quả trong một số vector biểu hiện, nhờ đó mà một lƣợng lớn protein ngoại lai đã đƣợc tiết ra ở mức độ cao, ví dụ nhƣ tín hiệu dẫn α-MF prepro gồm khoảng 89 acid amin có nguồn gốc từ S.
dàng. Trong khi chuyển vào lƣới nội chất, trình tự tiết α-MF prepro của protein sẽ đƣợc loại bỏ khỏi sản phẩm dịch mã sơ cấp và protein đƣợc tiết ra môi trƣờng là các protein hoàn chỉnh. Q trình này địi hỏi 3 loại enzyme phân hủy protein là: (1) peptidase cắt 19 acid amin ở vùng pre; (2) endopeptidase đƣợc mã hóa bởi gen
KEX2 sẽ cắt acid amin Lys và Arg ở đầu tận cùng C nối giữa α-MF prepro với
protein ngoại lai; (3) enzym dipeptid amino peptidase, sản phẩm của gen STE13, sẽ loại bỏ gốc Glu-Ala từ đầu tận cùng N của protein ngoại lai. Đồng thời trong khi đi vào lƣới nội chất protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác nhƣ quá trình glycosyl hóa. Đối với P. pastoris, q trình glycosyl hóa chuỗi polypeptide xảy ra ở nhóm hydroxyl của Serin và Threonin. Ở động vật có vú, chuỗi oligosaccarid đƣợc gắn bao gồm nhiều loại đƣờng khác nhau nhƣ N-acetylgalactosamine, galactose (Gal) và acid syalic (NeuAc). Còn ở sinh vật nhân chuẩn bậc thấp nhƣ P. pastoris thì chuỗi oligosaccarid đƣợc gắn vào chỉ có duy nhất gốc đƣờng mantose (Man).
Sau khi đƣợc chế biến trong mạng lƣới nội chất, protein sẽ đƣợc vận chuyển đến thể Golgi, tại đây chúng sẽ đƣợc bao gói trong các túi tiết và dung hợp với màng tế bào để tiết ra ngoài [7].
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid
Chủng vi sinh vật
- Chủng vi khuẩn E. coli DH10b của hãng Invitrogen (Mỹ) đƣợc sử dụng để tách dòng.
- Chủng nấm men P. pastoris SMD1168 của hãng Invitrogen (Mỹ) đƣợc sử
dụng làm chủng biểu hiện gen asp1. Plasmid
- pUC57 do hãng Invitrogen (Mỹ) sản xuất đƣợc sử dụng làm vector tách dòng.
- Plasmid pPIC9 của hãng Invitrogen (Mỹ) đƣợc dùng để biểu hiện gen asp1 trong P. pastoris.
Trình tự mồi
- Mồi xuôi (5’AOX1): 5’- gactggttccaattgacaac-3’ - Mồi ngƣợc (3’AOX1): 5’- gcaaatggcattctgacatcc-3’
2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị
Hóa chất
DNA chuẩn 1 kb (Fermentas, Mỹ); Tris (Merck, Đức); Taq polymerase (Fermentas, Mỹ); bacto trypton (Difco, Mỹ); isoamyl alcohol (Merck, Đức); kit tinh sạch DNA plasmid (Qiagen, Đức); RNase (Qiagen, Đức); agar (Titan, Ấn Độ); T4 DNA ligase (Fermentas, Mỹ); axít axetic (Merck, Đức); glucose (Merck, Đức); peptone (Difco, Mỹ); PEG 8000 (Sigma, Mỹ); cao nấm men (BD, Anh); YNB w/o aa (BD, Anh); các axít amin (Sigma, Mỹ); sorbitol (Sigma, Mỹ). Các hóa chất khác đƣợc mua từ hãng Merck.
DNA polymerase (Fermentas, Mỹ). Các loại enzyme hạn chế (Biolab, Mỹ) bao gồm: T4 DNA ligase; XhoI; NotI; StuI; SnaBI.
Máy móc thiết bị
Máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm Eppendorf (Sorvall RC5B, Mỹ); cân phân tích (Precisa, Thụy Sĩ); máy điện di DNA (Bio-rad, Mỹ); máy UV (Biorad, Mỹ); box cấy vô trùng (Sanyo); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (Gyromax); máy xung điện (Bio-rad, Mỹ); bể ổn nhiệt (Mỹ); máy điện di protein (Bio-rad, Mỹ); máy đo quang phổ (Bio-rad, Mỹ); máy đo pH (Metler,Thụy Sĩ); cân điện tử (Precisa, Thụy sĩ) và các máy khác thƣờng dùng trong
các phòng sinh học phân tử.
2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng sử dụng
2.1.3.1. Môi trƣờng và dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế bào
E. coli DH10b
Môi trƣờng
- Môi trƣờng Luria-Bertani (LB) lỏng: 0,5% cao nấm men; 1% pepton; 1% NaCl.
- Môi trƣờng chọn lọc LBA lỏng: môi trƣờng LB bổ sung ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.
- Mơi trƣờng chọn lọc LBA đặc: tƣơng tự nhƣ môi trƣờng LB lỏng nhƣng thêm agar 1,5%.
Dung dịch: CaCl2 0,1M vô trùng, giữ 4oC.
2.1.3.2. Dung dịch đƣợc sử dụng để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli - Dung dịch I (Sol I): 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM - Dung dịch I (Sol I): 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0.
- Dung dịch (Sol II): 0,2N sodium hydroxide; 1% SDS.
- Dung dịch (Sol III): 3M potassium acetate; 11,5% acetic acid.
- Dung dịch I và III đƣợc giữ ở 4oC; dung dịch II đƣợc chuẩn bị trƣớc khi sử dụng. - TE: 1M Tris-HCl; 0,5M EDTA, pH 8,0.
- Dung dịch phenol/ chloroform/ isoamylalcohol: 50 phenol: 49 chloroform: 1 isoamylalcohol.
- Gel agarose 0,8%: 0,8 g bột agarose pha trong 100 ml TAE 1 lần.
2.1.3.3. Dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose
- Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml): 24,2 g Tris-base; 5,71 ml glacial acetic acid; 10 ml EDTA 0,5M, pH 8,0.
- Đệm tra mẫu (6x) ( loading dye): 0,25% bromophenol blue; 0,25% xylen cyanol FF; 30% glycerol.
- Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml.
2.1.3.4. Mơi trƣờng biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm men
P. pastoris
- Môi trƣờng MD: 1,34% yeast nitrogen base (YNB); 4x10-5% biotin; 2% glucose.
- Môi trƣờng BMGY: 100 mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,43% YNB; 4x10-5% biotin; 1% glycerol; 0,5% cao nấm men; 1% pepton.
- Môi trƣờng BMMY: 100 mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,43% YNB; 4x10-5% biotin; 1% methanol, 0,5% cao nấm men; 1% pepton.
2.1.3.5. Dung dịch sử dụng trong điện đi SDS-PAGE
- Bis-acrylamide 30%: 30 g acrylamide và 0,8 g bis-acrylamide hịa tan trong 100 ml nƣớc cất vơ trùng, bảo quản ở 4oC.
- Đệm Tris 1,5M pH 8,8: Tris 0,75M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh đến pH 8,8.
- Đệm 0,5M pH 6,8: Tris 0,25M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh đến pH 6,8. - SDS 10% (100 ml): 10 g SDS và bổ sung nƣớc cất cho đến thể tích 100 ml. - Đệm chạy điện di: 0,05M Tris; 0,192M glycine; 0,1% SDS.
- APS 10%: 10 mg ammonium persulfate bổ sung nƣớc cất cho đến 100 ml. - TEMED: Sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ cơng ty hóa chất.
- Đệm xử lý mẫu 6X: 7 ml Tris-HCl 1M; pH 6,8; 3 ml glycerol 100%; 1g SDS; 0,6 ml 2-mercapto-ethanol; 1,2 mg bromophenol.
- Thành phần của bản gel polyacrylamide bao gồm:
Hóa chất Gel tách (12,6%) Gel cô (5%)
H2O 0,55 ml 0,45 ml Tris – HCl 1,125 ml (pH = 8,8) 0,2 ml (pH = 6,8) Glycerol 50% 0,9 ml Acrylamide 30% 1,80 ml 0,14 ml SDS 10% 45 l 4 l APS 10% 30 l 8 l TEMED 3l 1l
2.1.3.6. Dung dịch sử dụng trong nhuộm bạc
- Dung dịch cố định (50 ml): ethanol 50% (25 ml); acetic acid 12% (6 ml); formaldehyte 0,05% (69 µl); H2O 19 ml.
- Dung dịch rửa (50 ml): ethanol 50% (25 ml); H2O 25 ml.
- Dung dịch tăng độ nhạy (50 ml): Na2S2O3.5H2O 0,02% (2 ml); H2O 48 ml.
- Dung dịch nhuộm (50 ml): AgNO3 0,2% (0,1 g); formaldehyte 0,075% (140
µl); H2O 50 ml.
- Dung dịch hiện màu (50 ml): Na2S2O3 6% (3 g); Na2S2O3 5H2O 0,0004% (1 ml); formaldehyte 0,05% (69,4 µl); H2O 49 ml.
- Dung dịch dừng phản ứng (50 ml) glicine 1%: glicine 0,5 g; H2O 50 ml.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu phân tích và cải biến trình tự gen bằng các công cụ tin sinh
Trƣớc khi cải biến gen, trình tự gen ban đầu (A. oryzae asp) đƣợc phân tích sơ bộ bằng cơng cụ phân tích mã bộ ba hiếm (Rare codon analysis tool, Genscript). Công cụ này cho phép đánh giá khả năng biểu hiện của gen ngoại lai A. oryzae asp trong chủng chủ P. pastoris và S. cerevisiae thông qua chỉ số codon phù hợp (CAI – codon adaptation index). Ngoài ra, việc phân tích gen bằng cơng cụ này cịn cung
cấp thêm bảng phân bố các codon của gen ứng với tần suất sử dụng của nó trong chủng chủ, đề ra những hƣớng ban đầu để cải biến gen [63]. Công cụ Graphical Codon Usage Analyzer cho phép tìm ra và thay thế các codon có tần suất sử dụng rất thấp trong chủng chủ (là nguyên nhân chính làm giảm khả năng biểu hiện của gen ngoại lai trong chủng chủ). Công cụ Blast của NCBI đƣợc sử dụng để so sánh trình tự các gen cũng nhƣ protein mà gen mã hóa trƣớc và sau cải biến [61]. Gen sau cải biến sơ bộ (asp1) đƣợc thiết kế có thêm trình tự của enzyme hạn chế tạo thuận tiện cho các thao tác sinh học phân tử trong tạo dòng cũng nhƣ trong biểu hiện enzyme sau này. Các trình tự tín hiệu tiết khơng mong muốn có trong gen có thể đƣợc phát hiện bằng cơng cụ Predisi [58].
2.2.2. Phƣơng pháp PCR
Nguyên lý phản ứng PCR
PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase cùng với sự có mặt của mồi và nguyên liệu dNTPs. Sự khuếch đại này đƣợc thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (25-40 lần) gồm đun nóng khoảng 95oC (tháo xoắn chuỗi DNA), làm nguội xuống 37– 65oC (bắt cặp mồi với mạch đơn tƣơng ứng) và ủ ở khoảng 72oC (tổng hợp chuỗi). Nhờ vậy, 1 đoạn mạch kép DNA, sau n chu kỳ phản ứng, sẽ thành 2n mạch DNA kép [56].
Các bước thực hiện
Trƣớc khi tiến hành phản ứng PCR, các thành phần của phản ứng PCR cần phải đặt lên đá cho tan dần hoàn toàn. Các bƣớc làm phản ứng PCR đều phải tiến hành trên đá. Mẫu PCR tiến hành trong tổng thể tích cho mỗi mẫu phản ứng là 25 μl bao gồm các thành phần sau: - H2O: 8,7 µl - DNA khn: 1,0 µl - Dung dịch đệm 10X: 2,5 µl - Mồi xi 10 µM: 1 µl - Mồi ngƣợc 10 µM: 1 µl
- dNTP 2,5 mM: 2,5 µl
- MgSO4 2,5 mM: 8 µl
- Tap polymerase (5U/µl): 0,5 µl
- Gen asp1 đƣợc khuyếch đại theo chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bƣớc 1: 94oC 2 phút Bƣớc 2: 94 oC 30 giây Bƣớc 3: 55 oC 30 giây Bƣớc 4: 72 oC 1 phút 30 giây Bƣớc 5: 72 oC 10 phút Bƣớc 6: 4 oC vô cùng
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý điện di DNA
Các phân tử DNA (tích điện âm) dƣới tác dụng của điện trƣờng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Tốc độ di chuyển trên mạng lƣới gel trong điện trƣờng của DNA phụ thuộc vào kích thƣớc, điện tích, mức độ cuộn xoắn, cấu trúc phân tử. Đoạn DNA có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn đoạn DNA có kích thƣớc nhỏ hơn và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy [56].
Các bước thực hiện
Đun sôi gel agarose (0,8%) cho đến khi tan hết, để nguội đến khoảng 40- 50oC, đổ dung dịch vào khay gel điện di đã cài sẵn lƣợc để tạo các giếng nhỏ chứa mẫu. Nồng độ và độ dày của gel tuỳ thuộc mục đích sử dụng. Để thạch đơng và ổn định hoàn toàn trong 30 phút, gỡ lƣợc ra. Đặt khay gel vào bể điện di, đổ đệm chạy tới khi ngập bề mặt gel từ 1 đến 2 cm.
Mẫu DNA đƣợc trộn đều với đệm mẫu và đƣợc tra vào các giếng nhỏ trên gel và tiến hành điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V, quan sát sự di chuyển của vạch màu để ngừng quá trình điện di. DNA chuẩn đƣợc chạy cùng các mẫu để xác định khối lƣợng phân tử.
2.2.4. Quy trình biến nạp sốc nhiệt
Nguyên lý biến nạp sốc nhiệt
Tế bào E. coli khi đƣợc xử lý bằng các cation nhƣ calcium, magnesium,
manganese, rubidium hay hexamine cobalt sẽ bị thay đổi tính thấm của màng, do đó sẽ cho phép DNA đi vào tế bào vi khuẩn E. coli. Việc xử lý các cation cho phép làm trung hịa điện tích âm của màng ngồi tế bào, vốn dĩ bình thƣờng tích điện âm nên gây cản trở khơng cho phép DNA cũng tích điện tích âm đi xuyên qua lớp vỏ tế bào để đi vào bên trong tế bào. Tế bào sau khi bổ sung DNA đƣợc đặt trên đá để làm ổn định sự tƣơng tác giữa ion Ca2+ và các cấu trúc tích điện âm của màng DNA. Hỗn hợp này sau đó đƣợc đƣa vào bể ổn nhiệt 42oC trong một khoảng thời gian rất ngắn để làm thay đổi tính lƣu động của trạng thái bán tinh thể của màng tế bào, qua đó cho phép các phân tử DNA đi vào trong tế bào qua các kênh vận chuyển [56].
Các bước thực hiện
a. Quy trình tạo tế bào khả biến dùng cho biến nạp sốc nhiệt
Cấy ria chủng E. coli từ -80oC ra đĩa LB và ủ qua đêm ở 37o
C để chọn đƣợc khuẩn lạc rời. Lấy 1 khuẩn lạc cấy vào trong môi trƣờng LB lỏng, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC để làm tƣơi tế bào. Sang ngày thứ hai, pha lỗng dịch ni cấy (100 – 200 lần) vào trong 200 ml môi trƣờng LB mới, lắc tiếp ở 37o
C trong 2 giờ để làm tƣơi tế bào rồi thu mẫu khi OD đạt đƣợc từ 0,2 đến 0,4. Mẫu lấy ra đặt trong hộp đá 1 giờ rồi chia ra các ống Falcon, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, ở 4o
C. Thu tủa tế bào trong box. Tất cả các bƣớc tiếp theo đều phải làm trên đá.
Tủa tế bào đƣợc hòa lại bằng dung dịch CaCl2 0,1M cho tới thể tích tƣơng đƣơng ban đầu rồi để trong đá khoảng 10-15 phút. Sau đó mẫu đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Tủa tế bào đƣợc thu trong tủ cấy vơ trùng và hịa lại vào dung dịch CaCl2 0,1M, để trên đá trong một giờ. Mẫu tiếp tục đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Hòa tan tế bào thật đều trong CaCl2 0,1M có chứa glycerol 10-20% rồi chia ra mỗi ống nhỏ ra các ống Eppendorf. Giữ tế bào khả biến
ở -80oC. Đồng thời, cấy trải tế bào khả biến ra đĩa LB và LBA (100 μg/ml), ủ ở 37oC qua đêm để kiểm tra.
b. Quy trình biến nạp sốc nhiệt
Lấy ống tế bào khả biến dành cho biến nạp sốc nhiệt từ tủ -80oC, để trên đá 30 phút để cho ống tế bào tan dần. Lấy một lƣợng mẫu DNA cần biến nạp phù hợp cho vào ống tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng để mẫu phân bố đều trong tế bào khả