asp 1 TCGAACGTCACCTATGTGTTCACCAACCCCAATGGCCTGAACTTTACTCAGATGAACACC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 1 TCGAACGTCACCTATGTGTTCACCAACCCCAATGGCCTGAACTTTACTCAGATGAACACC 60 asp 61 ACCCTGCCAAACGTCACTATCTTCGCTACAGGCGGCACAATCGCTGGCTCCAGCGCCGAC 120 |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||| asp1 61 ACCCTGCCAAACGTCACTATCTTCGCGACAGGCGGCACAATCGCGGGCTCCAGCGCCGAC 120 asp 121 AACACCGCAACAACAGGTTACAAAGCCGGTGCAGTCGGCATCCAGACACTGATCGACGCT 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 121 AACACCGCAACAACAGGTTACAAAGCCGGTGCAGTCGGCATCCAGACACTGATCGACGCG 180 asp 181 GTCCCGGAAATGCTAAACGTTGCCAACGTCGCTGGCGTGCAAGTAACCAATGTCGGCAGC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 181 GTCCCGGAAATGCTAAACGTTGCCAACGTCGCTGGCGTGCAAGTAACCAATGTCGGCAGC 240 asp 241 CCAGACATCACCTCCGACATTCTCCTGCGTCTCTCCAAACAGATCAACGAGGTGGTCTGC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 241 CCAGACATCACCTCCGACATTCTCCTGCGTCTCTCCAAACAGATCAACGAGGTGGTCTGC 300 asp 301 AACGACCCCACCATGGCCGGTGCAGTGGTCACCCACGGCACCGACACGCTCGAAGAATCC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 301 AACGACCCCACCATGGCCGGTGCAGTGGTCACCCACGGCACCGACACGCTCGAAGAATCC 360 asp 361 GCCTTCTTCCTCGACGCCACGGTCAACTGTAGAAAGCCCGTGGTCATCGTCGGCGCCATG 420 |||||||||||||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||| asp1 361 GCCTTCTTCCTCGACGCCACGGTCAACTGTCGCAAGCCCGTGGTCATCGTCGGCGCCATG 420 asp 421 AGACCTTCAACCGCCATCTCGGCTGACGGCCCCCTCAACCTCCTGCAATCCGTCACCGTC 480 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 421 CGCCCTTCAACCGCCATCTCGGCTGACGGCCCCCTCAACCTCCTGCAATCCGTCACCGTC 480 asp 481 GCCGCTAGCCCCAAGGCCCGAGACAGAGGCGCCCTGATTGTCATGAACGACAGAATCGTA 540 ||||||||||||||||||||||| | |||||||||||||||||||||||| | |||||| asp1 481 GCCGCGAGCCCCAAGGCCCGAGACCGCGGCGCCCTGATTGTCATGAACGACCGCATCGTA 540 asp 541 TCCGCCTTCTACGCCTCCAAGACGAACGCCAACACCGTCGATACATTCAAGGCCATCGAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 541 TCCGCCTTCTACGCCTCCAAGACGAACGCCAACACCGTCGATACATTCAAGGCCATCGAA 600 asp 601 ATGGGTAACCTGGGCGAGGTCGTCTCCAACAAACCCTACTTCTTCTACCCCCCAGTCAAG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 601 ATGGGTAACCTGGGCGAGGTCGTCTCCAACAAACCCTACTTCTTCTACCCCCCAGTCAAG 660 asp 661 CCAACAGGCAAGACGGAAGTAGATATCAGAAACATCACCTCCATCCCCAGAGTCGACATC 720 ||||||||||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||
asp1 661 CCAACAGGCAAGACGGAAGTAGATATCCGGAACATCACCTCCATCCCCAGAGTCGACATC 720 asp 721 CTCTACTCATACGAAGACATGCACAATGACACCCTTTACTCCGCCATCGACAACGGCGCA 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 721 CTCTACTCATACGAAGACATGCACAATGACACCCTTTACTCCGCCATCGACAACGGCGCA 780 asp 781 AAGGGCATCGTTATCGCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGTCTCCACCCCCTTCAGCGCCGCC 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 781 AAGGGCATCGTTATCGCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGTCTCCACCCCCTTCAGCGCCGCC 840 asp 841 ATGGAAGACATCACAACCAAACACAACATCCCCATCGTAGCCAGCACGAGAACCGGAAAC 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | ||||||||| asp1 841 ATGGAAGACATCACAACCAAACACAACATCCCCATCGTAGCCAGCACGCGCACCGGAAAC 900 asp 901 GGGGAGGTGCCGTCCTCCGCCGAGTCGAGCCAGATCGCAAGCGGGTATTTGAACCCCGCA 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 901 GGGGAGGTGCCGTCCTCCGCCGAGTCGAGCCAGATCGCAAGCGGGTATTTGAACCCCGCA 960 asp 961 AAGTCAAGAGTTTTGCTTGGCTTGTTGCTTGCCCAGGGGAAGAGTATTGAGGAAATGAGG 1020 |||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| asp1 961 AAGTCACGCGTTTTGCTTGGCTTGTTGCTTGCCCAGGGGAAGAGTATTGAGGAAATGAGG 1020 asp 1021 GCTGTTTTTGAGAGAATTGGGGTTGCTTGA 1050 || ||||||||| | ||||||||||||||| asp1 1021 GCGGTTTTTGAGCGGATTGGGGTTGCTTGA 1050
Hình 11. So sánh trình tự gen asp1 đã đƣợc cải biến và trình tự gen asp chƣa cải biến 3.1.3. Đánh giá các chỉ số phù hợp mã bộ ba của gen asp1 đối với chủng biểu hiện
Sau cải biến, chỉ số CAI phù hợp giữa gen asp1 với chủng biểu hiện P. pastoris tăng từ 0,58 lên 0,63. Đối với hệ biểu hiện P. pastoris, gen asp1 khơng cịn
mang codon nào có tần suất sử dụng thấp dƣới 20% thay vào đó là các bộ ba có tần số sử dụng cao 90-100%, phù hợp với chủng biểu hiện đã tăng từ 26% lên 30%. (Hình 12).
Hình 12. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định
biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ phần trăm phù hợp của các bộ mã của gen
asp1 khi đƣợc biểu hiện trong chủng biểu hiện P. pastoris (B)
Vị trí tƣơng đối của mã bộ ba
Tầ n số t ƣơng đối Tỷ lệ phầ n tră m m ã bộ b a A B Mức độ phù hợp của các mã bộ ba
3.1.4. Thiết kế vùng gen để biểu hiện asp1 trong P. pastoris
Gen asp1 sau tổng hợp sẽ đƣợc nhân dòng rồi đƣa trực tiếp vào vector biểu hiện pPIC9 để biểu hiện trong P. pastoris. Do đó, một số thay đổi nhỏ đã đƣợc đƣa vào gen asp1 để tạo thuận lợi trong các thao tác sinh học phân tử trong q trình
tách dịng gen và tạo chủng tái tổ hợp sau này.
AACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCGAACGTCACCTATGTGTTCACCAACCCCAAT GGCCTGAACTTTACTCAGATGAACACCACCCTGCCAAACGTCACTATCTTCGCTACAGGC GGCACAATCGCTGGCTCCAGCGCCGACAACACCGCAACAACAGGTTACAAAGCCGGTGCA GTCGGCATCCAGACACTGATCGACGCTGTCCCGGAAATGCTAAACGTTGCCAACGTCGCT GGCGTGCAAGTAACCAATGTCGGCAGCCCAGACATCACCTCCGACATTCTCCTGCGTCTC TCCAAACAGATCAACGAGGTGGTCTGCAACGACCCCACCATGGCCGGTGCAGTGGTCACC CACGGCACCGACACGCTCGAAGAATCCGCCTTCTTCCTCGACGCCACGGTCAACTGTAGA AAGCCCGTGGTCATCGTCGGCGCCATGAGACCTTCAACCGCCATCTCGGCTGACGGCCCC CTCAACCTCCTGCAATCCGTCACCGTCGCCGCTAGCCCCAAGGCCCGAGACAGAGGCGCC CTGATTGTCATGAACGACAGAATCGTATCCGCCTTCTACGCCTCCAAGACGAACGCCAAC ACCGTCGATACATTCAAGGCCATCGAAATGGGTAACCTGGGCGAGGTCGTCTCCAACAAA CCCTACTTCTTCTACCCCCCAGTCAAGCCAACAGGCAAGACGGAAGTAGATATCAGAAAC ATCACCTCCATCCCCAGAGTCGACATCCTCTACTCATACGAAGACATGCACAATGACACC CTTTACTCCGCCATCGACAACGGCGCAAAGGGCATCGTTATCGCCGGCTCCGGCTCCGGC TCCGTCTCCACCCCCTTCAGCGCCGCCATGGAAGACATCACAACCAAACACAACATCCCC ATCGTAGCCAGCACGAGAACCGGAAACGGGGAGGTGCCGTCCTCCGCCGAGTCGAGCCAG ATCGCAAGCGGGTATTTGAACCCCGCAAAGTCAAGAGTTTTGCTTGGCTTGTTGCTTGCC CAGGGGAAGAGTATTGAGGAAATGAGGGCTGTTTTTGAGAGAATTGGGGTTGCTTAAGCG GCCGCGAAA
Hình 13 .Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt của
tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt của enzyme giới hạn
XhoI, NotI (đƣợc tơ đậm)
Vùng gen cần đặt đƣợc đƣa thêm các trình tự nhƣ sau:
- Thứ nhất, trình tự gen asp1 khơng cần mang mã mở đầu (ATG) ở đầu 5’vì dự định gen sẽ đƣợc phiên mã từ mã khởi đầu của trình tự peptide tín hiệu trên vector pPIC9.
- Thứ hai, để đảm bảo sau khi cắt bỏ tín hiệu tiết, enzyme đƣợc tiết ra môi trƣờng là enzyme ngun vẹn có trình tự amino acid chính xác nhƣ trình tự của
asparaginase nguyên thủy, gen sẽ đƣợc đƣa vào vector pPIC9 tại vị trí của enzyme
XhoI trên vector, nằm trƣớc trình tự cắt của peptide tín hiệu. Vì vậy, tồn bộ vùng
gen từ trình tự nhận biết của XhoI tới vị trí cắt của peptide tín hiệu
(GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT) sẽ đƣợc đƣa vào trình tự gen asp1 để tổng
hợp.
-Thứ ba, trình tự nhận biết của hai enzyme hạn chế đƣợc dùng để đƣa gen
asp1 vào vector pPIC9 cũng đƣợc đƣa vào trình tự tổng hợp: trình tự nhận biết của XhoI (CTCGAG) đƣợc đƣa vào đầu 5’ và trình tự nhận biết của NotI
(GCGGCCGC) vào đầu 3’.
- Thứ tƣ, mã kết thúc (TAA) cũng đã thay thế cho mã kết thúc (TGA) để làm tăng khả năng biểu hiện gen asp1 trong P. pastoris.
Nhƣ vậy, cấu trúc mang gen asp1 cần đặt để tổng hợp là XhoI – tín hiệu tiết
– asp1 – NotI với tổng chiều dài 1088 bp (Hình 13).
3.2. NHÂN DỊNG GEN ASP1
Gen biểu hiện asp1 đƣợc Genscript tổng hợp và đƣa vào vector pUC57 để
tạo thành vector pUC-asp1. Tuy nhiên, lƣợng vector mà công ty gửi về không đủ để thu gen chuyển vào vector biểu hiện nên chúng tôi đã tiến hành biến nạp plasmid pUC-asp1 vào tế bào E. coli DH10b để nhân dòng gen, đồng thời kiểm tra lại gen bằng enzyme hạn chế trƣớc khi chuyển vào vector biểu hiện.
Vector pUC57 là vector có kích thƣớc nhỏ (2710 bp) so với các vector tách dòng thế hệ trƣớc, phù hợp với mục đích tách dịng: chứa gen bla mã hóa β- lactamase kháng ampicillin giúp cho quá trình chọn lọc các tế bào mang plasmid chứa gen ngoại lai; có vùng đa nối thuận lợi cho việc ghép nối các đoạn ADN ngoại lai. Kết quả là chỉ tế bào vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp mới có khả năng mọc trên mơi trƣờng nuôi cấy và tạo thành khuẩn lạc. Sau khi biến nạp vào tế bào E. coli DH10b, ba dòng tế bào đã đƣợc chọn để tách plasmid và kiểm tra plasmid bằng các enzyme hạn chế.
Theo tính tốn lý thuyết plasmid tái tổ hợp pUC-asp1 có kích thƣớc khoảng 3,8 kb, dài hơn so với plasmid gốc (2,7 kb), nên sẽ di chuyển chậm hơn khi chạy điện di trên gel agarose, dẫn tới sẽ nằm ở vị trí cao hơn so với chủng đối chứng pUC57 trên bản điện di (Hình 14).
Hình 14. Phân tích các dòng plasmid pUC-asp1 trên gel điện di agarose 1%. 1, 2, 3:
plasmid pUC57 mang gen asp1 đƣợc tách từ các dòng E. coli tái tổ hợp tƣơng ứng.
pUC57: vector pUC57 không mang gen đƣợc dùng làm đối chứng
3.2.1. Kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp bằng các enzyme hạn chế
Để kiểm tra sự có mặt của gen asp1 trong plasmid tái tổ hợp thu đƣợc, chúng tôi đã tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp thu đƣợc cùng lúc bằng cặp enzyme hạn chế XhoI và NotI. Cặp enzyme này đƣợc thiết kế nằm ở hai đầu 5’ và 3’ của gen
asp1 khi đặt trình tự để tổng hợp nhân tạo, và khơng có mặt ở trong vùng đa nối của
vector pUC57. Do đó, khi xử lý sản phẩm tách plasmid từ chủng tái tổ hợp E. coli bằng cặp enzyme này, chỉ có những plasmid pUC57 mang gen asp1 mới bị cắt, cho ra hai đoạn DNA có kích thƣớc 2,7 kb (tƣơng ứng với vector pUC57 mở vòng) và 1,1 kb (tƣơng ứng với gen asp1) (Hình 15).
Từ hình 15 ta thấy, cả ba dịng plasmid tái tổ hợp tách đƣợc đều mang gen
asp1, ứng với băng DNA kích thƣớc 1,1 kb trên bản điện di DNA trên gel agarose.
Hình 15. Phân tích sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1 bằng cặp enzyme XhoI và NotI
trên gel agarose 1%. 1, 2, 3: Sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1; M: DNA chuẩn 1 kb (Fermentas)
3.2.2 Giải trình tự gen asp1
Sau khi kiểm tra đƣợc sự có mặt của gen asp1 trong các dòng E. coli tái tổ
hợp có đƣợc, chúng tơi đã lựa chọn dịng số 3 để tiến hành tách, tinh sạch lƣợng lớn plasmid pUC-asp1 để giải trình tự. Kết quả cho thấy gen ngoại lai trong vector pUC-asp1 tƣơng đồng 100% với trình tự gen asp1 đã đƣợc đặt tổng hợp. Plasmid
này đã đƣợc tách với lƣợng lớn để thu gen asp1 và chuyển gen sang vector pPIC9.
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu hiện pPIC9 3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu hiện pPIC9
Vector pPIC9 đƣợc cắt kiểm tra lần lƣợt bằng hai enzyme XhoI và NotI.
Do vector pPIC9 chỉ mang duy nhất một trình tự nhận biết cho enzyme XhoI và
NotI, vector này sẽ mở vòng khi bị xử lý bằng XhoI, NotI, cho ra một băng duy nhất
có kích thƣớc khoảng 8 kb, đúng nhƣ tính tốn lý thuyết (Hình 16). 1 2 3 M kb 3,0 6,0 2,7 kb 1 M 2 10 kb 1,1 kb 1,0
Hình 16. Sơ đồ vector pPIC9 (trái) và ảnh điện (phải) kết quả cắt pPIC9 bằng NotI
(đƣờng chạy 1) và XhoI ( đƣờng chạy 2)
Vector pPIC9 sau đó đƣợc tiến hành cắt lƣợng lớn bằng cả hai enzyme
XhoI và NotI, tạo 2 đầu dính phù hợp để dùng cho phản ứng lai ghép với gen asp1
cũng đƣợc xử lý cắt bằng hai enzyme đó. Plasmid pPIC9 sau khi cắt bằng cặp enzyme hạn chế đƣợc tinh sạch bằng bộ sinh phẩm của Qiagen nhằm thu đƣợc đúng một băng pPIC9 mở vòng sạch, làm nguyên liệu cho phản ứng lai ghép (Hình 17).
Tƣơng tự nhƣ vậy, đoạn gen asp1 cũng đƣợc cắt ra khỏi vector pUC-asp1
bằng cặp enzyme hạn chế XhoI và NotI nhằm thu đƣợc một băng asp1 tinh sạch có kích thƣớc 1,1 kb (Hình 17). Sau đó, chúng tơi tiến hành nối gen asp1 vào vectơ
pPIC9 đã đƣợc cắt với cặp enzyme hạn chế tƣơng ứng để tạo thành vector tái tổ hợp pPIC-asp1 và biến nạp vào chủng E. coli DH10b để tách dòng gen. Các dòng tế bào
E. coli đƣợc biến nạp thành công đƣợc chọn lọc trên mơi trƣờng LBA. Do plasmid
pPIC-asp1 có mang gen amp kháng ampicilin nên chỉ có những dịng tế bào E. coli chứa plasmid pPIC-asp1 mới có khả năng mọc trên đĩa thạch. Một khuẩn lạc mọc trên đĩa LBA chứng tỏ có mang plasmid.
1,0
10
Hinh 17. Phân tích gen asp1, pPIC9 sau khi đã đƣợc cắt bằng cặp enzyme
NcoI+XhoI và đƣợc tinh chế trên gel agarose 1%.
3.3.2. Kiểm tra gen asp1 trong plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 bằng PCR
Do quá trình ghép nối, vector pPIC9 có thể tự đóng vịng. Để xác định đúng thể biến nạp mang đúng plasmid tái tổ hợp pPIC9-asp1, chúng tôi tiến hành PCR khuẩn lạc mọc trên đĩa LBA để khuếch đại đoạn ADN nằm giữa hai trình tự 5’AOX1 và 3’AOX1 trên vector pPIC9 bằng kỹ thuật PCR. Cặp mồi dùng để nhân
gen đƣợc thiết kế chuyên dùng để khuếch đại gen AOX1 với mồi xuôi bắt cặp với trình tự đầu 5’ và mồi ngƣợc bắt cặp với trình tự đầu 3’.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc E. coli DH10b mang plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 bằng cặp mồi AOX1 cho thấy, ở cả 6 đƣờng chạy ứng với 6 dòng E. coli tái tổ hợp đƣợc chọn đều đều xuất hiện một băng DNA có kích
thƣớc khoảng 1,6 kb (Hình 18). Gen asp1 có kích thƣớc khoảng 1,1 kb đƣợc chèn vào vùng đa nối nằm trong gen AOX1 của plasmid pPIC9 (kích thƣớc gần 500 bp). Do đó, khi tiến hành phản ứng PCR bằng cặp mồi AOX1 với mẫu là plasmid pPIC9 mang gen ngoại lai, kết quả thu đƣợc sẽ ln là một băng DNA có kích thƣớc bằng kích thƣớc của gen ngoại lại cộng với kích thƣớc gen AOX1 của plasmid (0,5 kb). Trong trƣờng hợp này, sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc 1,6 kb, chính bằng kích thƣớc của gen asp1 (1 kb) cộng với kích thƣớc của AOX1 (0,5 kb). Điều đó chứng tỏ chúng tơi đã thiết kế thành công plasmid pPIC9 mang gen asp1.
1,0 3,0 1,1 kb 8,0 kb 10 1,0 3,0 10
3.3.3. Tách lƣợng lớn vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen asp1
Chủng E. coli tái tổ hợp mang pPIC-asp1 (dòng một) đƣợc lựa chọn để
ni lƣợng lớn trong mơi trƣờng LBA và sau đó tiến hành tách plasmid. Vector tái tổ hợp pPIC-asp1 sau khi đƣợc tách lƣợng lớn thành cơng (Hình 19A) đã đƣợc tiến hành xử lý bằng một số enzyme hạn chế để kiểm tra. Do pPIC-asp1 có mang một điểm nhận biết của enzyme NotI và XhoI ở hai đầu 3’ và 5’ tƣơng ứng của gen asp1, gen asp1 có kích thƣớc khoảng 1,1 kb sẽ bị cắt ra khỏi vector pPIC9 khi pPIC-asp1 bị cắt đồng thời bằng cặp hai enzyme hạn chế đó. Nhìn vào hình 19B ta thấy, pPIC-
asp1 sau khi xử lý bằng cặp enzyme NotI và XhoI đã cho ra hai băng DNA có kích
thƣớc khoảng 8,0 kb và 1,1 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc của pPIC9 và gen asp1 đúng nhƣ tính tốn lý thuyết. Điều đó chứng tỏ chúng tơi đã tách chính xác vector tái tổ hợp pPIC9 mang gen asp1.
kb 10,0 6,0 1,5 3,0 1 2 3 4 5 6 M 1,6 kb
Hình 18. Ảnh điện di kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen asp1 trong vector
Hình 19. Phân tích plasmid pPIC-asp1 và sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 bằng
NotI và XhoI trên gel điện di agarose 1%
3.4. TẠO CHỦNG NẤM MEN P. PASTORIS MANG ASP1
Để biểu hiện gen, chúng tôi sử dụng chủng nấm men P. pastoris SMD1168. Chủng này bị đột biến gen pep4 là gen mã hóa cho carboxypeptidase A cần thiết
cho sự kích hoạt các protease khác nên có ƣu điểm lớn trong việc hạn chế các protein ngoại lai bị cắt (pep4-). Đồng thời chủng có chứa his4 mã hóa protein
histidinol dehydrogenase đã bị gây đột biến nên chủng chỉ phát triển trên môi trƣờng cơ bản có bổ sung histidine (His-). Đây là chỉ thị nhận biết chủng chứa vector biểu hiện sau biến nạp do vector biểu hiện chứa gen his4 bình thƣờng. Hơn
nữa, chủng có kiểu hình Mut+
mang gen aox1, aox2 đáp ứng đƣợc enzyme alcohol oxidase cho tế bào chuyển hóa methanol tốt cho chủng sinh trƣởng và tổng hợp protein ngoại lai.
Để tích hợp pPIC-asp1 vào hệ gen nấm men P. pastoris SMD1168, enzyme
hạn chế StuI (vị trí nhận biết trên gen his4) đƣợc sử dụng để cắt mở vịng pPIC-asp1 cho ra một băng DNA có kích thƣớc khoảng 9,1 kb bằng tổng kích thƣớc của pPIC9 (8,0 kb) cộng với gen asp1 (1,1 kb). Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra trên gel agarose
.
pPIC-asp1 pPIC9 pPIC-asp1 M
A B kb 10 3,0 1,0 8,0 kb 1,1 kb
0,8% và đƣợc tinh chế bằng bộ kit Qiagen (Hình 20). pPIC-asp1 mở vịng sẽ đƣợc tích hợp vào locus HIS4 trong hệ gen của tế bào nấm men P. pastoris SMD 1168. Các thể biến nạp sau đó đƣợc ủ trên mơi trƣờng MD (khuyết dƣỡng histidin) trong 3 ngày ở 28oC. Kết quả là các dòng nấm men đã mọc đều màu trắng và tách biệt với nhau (Hình 21). Những khuẩn lạc mọc trên mơi trƣờng MD chứng tỏ chúng có khả năng tổng hợp histidine, nhƣ vậy chúng tôi đã biến nạp thành công vector PIC-asp1 vào tế bào nấm men P. pastoris.
Hình 20. Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 bằng StuI
Hình 21. Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P. pastoris
Theo nguyên lý khi plasmid đƣợc chuyển vào tế bào có thể xảy ra sự sáp nhập vào bộ gen của tế bào nấm men theo hai phƣơng thức: chèn gen và thay thế gen. Do chiến lƣợc sử dụng hƣớng đến phƣơng thức tái tổ hợp tƣơng đồng tại vị trí promoter
pPIC-asp1 M kb 10 3,0 1,0 9,1 kb
AOX1 nên đa phần các thể biến nạp sẽ có sự chèn gen [5]. Khi đƣợc mở vòng bằng
StuI, plasmid pPIC–asp1 đƣợc định hƣớng trao đổi chéo và cài toàn bộ cấu trúc biểu
hiện gen ngoại lai vào vùng gen his4 trong hệ gen. Vì thế, cấu trúc gen AOX1 trong hệ gen đƣợc bảo toàn để sản xuất enzyme alcohol oxidase chuyển hóa nguồn methanol nhƣ nguồn carbon cho nấm men sinh trƣởng. Đây là kiểu hình Mut+ của chủng tái tổ hợp đƣợc ƣu tiên lựa chọn vì methanol vừa đƣợc sử dụng làm chất cảm ứng sinh tổng hợp protein ngoại lai vừa là nguồn carbon để chủng sinh trƣởng tốt [6]. Tuy nhiên do sự tái tổ hợp vẫn có thể thay thế gen vì vậy, sau khi biến nạp tạo plasmid pPIC–asp1 vào chủng nấm men P. pastoris, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra sàng lọc kiểu hình Mut+
của chủng tái tổ hợp bằng PCR sử dụng cặp mồi AOX1 (Invitrogen).
Kết quả (Hình 22) cho thấy sản phẩm PCR từ 4 chủng tái tổ hợp đều mang hai gen đƣợc khuếch đại: (1) gen AOX1 trong genome nấm men (kích thƣớc 2,2 kb); (2) cấu trúc mang gen asp1 trong vector (kích thƣớc 1,6 kb bằng kích thƣớc của gen ngoại lai 1,1 kb và đoạn gen AOX1 trên vector pPIC9 có kích thƣớc 0,5 kb). Nhƣ vậy, các chủng tái tổ hợp đƣợc lựa chọn đều có kiểu hình Mus+.
Hình 22. Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P.
pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1. 1- 4: Sản phẩm PCR từ bốn
chủng tái tổ hợp khác nhau. M: Thang DNA chuẩn
1000 1 2 3 4 M kb 0,75 1,5 3,0 2,2 kb 1,6 kb 2,0 10 1,0
3.5. BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P. PASTORIS SMD1168 TRONG BÌNH TAM GIÁC SMD1168 TRONG BÌNH TAM GIÁC