Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6. Kiểm tra DNA thu đƣợc bằng enzyme hạn chế
Nguyên lý
Các enzyme hạn chế có thể nhận biết và cắt DNA sợi khép tại các vị trí đặc hiệu trong điều kiện thích hợp (thƣờng 37oC và trong các đệm tƣơng ứng với từng loại enzyme) [56].
Các bước thực hiện
Hỗn hợp phản ứng cắt của enzyme hạn chế thƣờng đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 10µl gồm có các thành phần sau:
- dH2O: 6,7 µl
- Đệm 10x: 1,0 µl
- DNA plasmid: 2,0 µl
- Enzyme hạn chế: 0,3 µl
Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều và ủ ở nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của enzyme trong một khoảng thời gian thích hợp, từ một tới ba giờ. Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose với nồng độ phù hợp.
2.2.7. Tinh sạch DNA plasmid bằng cột Qiagen
Bổ sung ba thể tích dung dịch QG với một thể tích isopropanol vào dung dịch DNA plasmid sau khi tách đƣợc. Chuyển hỗn hợp dịch sang cột Qiagen, thể tích mỗi lần chuyển tối đa là 800 μl. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút hoặc cho tới khi dịch qua hết cột. Loại bỏ dịch thu đƣợc.
Bổ sung tiếp dung dịch PE vào cột để rửa mẫu. Để cột trong PE từ 2-5 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bẩn. Bỏ dịch thu đƣợc ở ống thu, ly tâm thêm lần nữa 13000 vịng/phút trong 1 phút để loại hồn tồn dịch PE còn dƣ trên cột.
Chuyển cột qua một ống Eppendorf mới. Bổ sung ddH2O đợi 2-5 phút. Nƣớc có khả năng tạo một lớp vỏ hydrate và tách DNA ra khỏi cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu đƣợc dịch DNA hòa tan trong nƣớc. Dung dịch này đƣợc điện di kiểm tra hàm lƣợng DNA thu đƣợc sau tinh sạch rồi gửi đi giải trình tự hoặc đƣợc giữ ở -80oC dùng làm nguyên liệu để thực hiện các công việc tiếp theo.
2.2.8. Phản ứng nối ghép gen
Nguyên lý
Nhờ sự xúc tác của enzyme T4-DNA ligase, các liên kết phosphodieste sẽ đƣợc hình thành giữa hai nucleotide cạnh nhau (gốc phosphate đầu 5’ của đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide đoạn DNA kia), đồng thời giải phóng một phân tử nƣớc [56].
Các bước thực hiện
Tùy thuộc vào nồng độ và chiều dài của các đoạn DNA cần nối mà có tỷ lệ trộn vector và đoạn gen nối khác nhau, thƣờng tỷ lệ vector: gen đƣợc gép nối là 1:3. Phản ứng nối ghép đƣợc tiến hành gồm các thành phần nhƣ sau:
- pPIC9: 2 µl
- Gen asp1; 6 µl - Đệm 10x cho ligase: 1 µl
- T4 ligase: 1 µl
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 3 giờ, sau đó làm biến tính enzyme ở 65oC trong 10 phút. Sản phẩm bảo quản ở - 20oC.
2.2.9. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện
Tế bào nấm men đƣợc cấy ria từ ống giữ mẫu trong -80oC ra đĩa YPD đặc và nuôi ở 30oC trong từ 2 đến 3 ngày để thu khuẩn lạc rời. Một khuẩn lạc nấm men sau
đó đƣợc cấy vào môi trƣờng YPD lỏng và nuôi qua đêm ở 30oC. Sang ngày thứ 2 cấy chuyển nấm men sang môi trƣờng YPD mới và tiếp tục cấy đến khi OD đạt đƣợc trong khoảng từ 1,3 đến 1,6. Tế bào đƣợc thu lại bằng ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Thêm 40 ml nƣớc lạnh vô trùng, lắc đều và ly tâm thu tế bào ở 3000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào đƣợc rửa bằng 20 ml nƣớc lạnh vơ trùng, sau đó hịa vào 10 ml sorbitol 1M, lắc đều trên đá 5 phút rồi ly tâm 3000v/p trong 5 phút ở 4ºC để thu tế bào. Thêm 100 µl sorbitol 1M, lắc đều rồi chia ra 2 ống Eppendorf. Cho vào 1 ống Eppendorf 10 µl DNA cần biến nạp, ống cịn lại làm đối chứng không cho DNA (thay vào đó là 10 µl dH2O vơ trùng) rồi tiến hành xung điện. Các thông số xung điện nhƣ sau: C = 25 μF; V = 1,5 V; R = 200 Ω. Ngay sau khi xung điện xong bổ sung 600 µl sorbitol 1M. Trải tế bào nấm men sau biến nạp lên đĩa chứa môi trƣờng MD (đối với chủng P. pastoris). Ủ đĩa ở 30oC trong khoảng 2 – 3 ngày cho đến khi nhìn thấy khuẩn lạc tế bào nấm men.
2.2.10. Lên men chủng P. Pastoris
Các tế bào P. pastoris mang vector biểu hiện pPIC–asp1 đƣợc nuôi cấy sinh
tổng hợp protein ngoại lai bằng cách nuôi một khuẩn lạc đơn trong 25 ml môi trƣờng BMGY trong bình tam giác 250 ml tại nhiệt độ 28–30°C, lắc 250-300 vòng/phút qua đêm đến khi OD600 đạt khoảng 2-6 (trong khoảng 16-18 giờ) thì tiến hành thu tế bào bằng cách ly tâm ở 1500-3000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ
phòng. Tế bào đƣợc hịa vào mơi trƣờng BMMY sao cho OD600 ~ 1 và đƣợc nuôi
28–30°C, 250 -300 vòng/phút. Methanol đƣợc bổ sung theo ngày, mỗi ngày một lần nồng độ thích hợp 0,5% để cảm ứng sinh tổng hợp asparaginase tái tổ hợp đồng thời làm nguồn carbon cho tế bào sinh trƣởng. Dịch nuôi cấy tế bào đƣợc thu lại sau 21, 37, 46, 54, 72 giờ bằng cách ly tâm loại tế bào ở 3000 vòng/phút trong 10 phút.
2.2.11. Điện di SDS – PAGE
Nguyên lý
Các protein khác nhau có điện tích và hình dạng khác nhau, vì vậy chúng không thể di chuyển vào gel polyacrylamide với tốc độ nhƣ nhau. Mẫu protein trƣớc khi điện di cần phải đƣợc biến tính với sự có mặt của SDS. SDS là một chất tích điện
âm có khả năng gây biến tính protein bằng cách bao bọc xung quanh chuỗi polypeptide dẫn đến các phân tử protein trở thành dạng thẳng và tích điện âm. Do đó, sự di chuyển của các protein khác nhau đƣợc phân biệt chỉ dựa vào trọng lƣợng phân tử mà khơng phụ thuộc vào điện tích hay hình dạng của chúng [56].
Quy trình
a. Điện di biến tính trên gel polyacrylamide
Sau khi nuôi cấy ở điều kiện cảm ứng, dịch nuôi cấy thu lại sau khi đã ly tâmloại bỏ tế bào. Protein đƣợc xử lý biến tính bằng đệm xử lý mẫu ( treatment buffer 6X) và ủ ở 100oC trong 10 phút. Chuẩn bị gel poly-acrylamide, tiến hành lắp bản gel, tra mẫu vào giếng và chạy với cƣờng độ dòng điện 10mA cho mỗi bản gel cho đến khi mẫu qua hết lớp gel cơ. Sau đó cƣờng độ dịng điện đƣợc tăng lên 20mA cho mỗi bản gel khi mẫu đến lớp gel tách. Gỡ bản gel và nhuộm gel với bạc.
b. Nhuộm bạc
Ngâm bản gel sau khi đƣợc gỡ ra khỏi giá bằng dung dịch cố định gel trong thời gian hơn 1 giờ. Sau đó rửa bản gel 2 lần với dung dịch rửa, mỗi lần 20 phút để bỏ acetic acid, các chất bẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định. Chuyển bản gel vào dung dịch tăng độ nhạy trong 1 phút và rửa nhanh với nƣớc cất trong 3 lần mỗi lần 20 giây. Tiếp tục chuyển bản gel vào dung dịch nhuộm bạc trong thời gian từ 20-30 phút, rửa bản gel 2 lần bằng nƣớc cất mỗi lần 20 giây để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu. Chuyển bản gel vào dung dịch hiện màu cho đến khi băng protein xuất hiện, rửa lại bản gel 3 lần bằng nƣớc cất, mỗi lần 20 giây. Dừng phản ứng phát triển màu khi thu đƣợc hình ảnh tối ƣu càng nhanh càng tốt bằng cách đặt bản gel vào dung dịch dừng phản ứng trong 10 phút.
2.2.12. Thử hoạt tính asparaginase bằng phƣơng pháp điện di khơng biến tính và thử hoạt tính bằng đặt gel trên đĩa thạch và thử hoạt tính bằng đặt gel trên đĩa thạch
Nguyên lý
Gel poly-acrylamide và đệm chạy khơng chứa SDS thì sau khi chạy điện di xong mẫu protein vẫn giữ đƣợc hoạt tính ban đầu. Để thử hoạt tính asparaginase
tiến hành đặt bản gel chạy điện di khơng biến tính lên đĩa thạch có chứa phenol đỏ và cơ chất asparagine.
Phenol đỏ là một chất chỉ thị pH thƣờng dùng trong các phòng sinh học phân tử tế bào, khi gặp mơi trƣờng có pH lớn hơn 8,2 sẽ chuyển sang màu hồng đậm với mơi trƣờng có pH nhỏ hơn 6,8 sẽ chuyển sang màu vàng, trong khoảng 6,8 đến 8,2 sẽ có màu cam. Phản ứng cơ chất của enzyme asparaginase với cơ chất asparagine tạo ra sản phẩm là acid aspatic và ammomium. Sau phản ứng ammonium sẽ bay hết, để lại trên đĩa thạch acid aspatic do vậy xuất hiện băng màu vàng nhạt, trong sau khi ủ 20 phút ở nhiệt độ 37oC [57].
Quy trình
Chạy điện di khơng biến tính hai bản gel giống nhau (Sau khi chạy xong một bản gel đƣợc nhuộm coommasie; bản còn lại đƣợc rửa bằng nƣớc cất trong 15 phút, 2 phút thay nƣớc một lần). Trong quá trình điện di, đổ đĩa thạch chứa asparagine và phenol đỏ với thành phần: agar 1,8%: 10 ml; phenol đỏ 2,5%: 2,5 ml; asparagine 2,5%: 8 ml; nƣớc cất: 20ml. Sau khi rửa xong bản gel và đĩa thạch đã khô, ép bản gel vừa rửa lên đĩa thạch và ủ ở 37oC trong 20 phút. Quan sát vùng biến đổi pH trên đĩa thạch.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Chế phẩm asparaginase tái tổ hợp có nguồn gốc từ A. oryzae đã đƣợc Tổ chức Y tế thế giới và Tổ chức Nơng Lƣơng thế giới chứng nhận là enzym an tồn dùng trong thực phẩm. Vì vậy việc lựa chọn gen asparaginase từ A. oryzae để biểu hiện sẽ giúp giảm đƣợc thời gian và kinh phí để đánh giá đặc tính enzyme và tính an tồn của enzyme, trong khi đó hệ thống đánh giá tính an tồn trong nƣớc chƣa đƣợc chuẩn hóa và chƣa đƣợc WHO/FAO chứng nhận.
Tuy nhiên, việc tổng hợp A. oryzae asparaginase tái tổ hợp trong chủng nấm sợi A. oryzae trong điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam gặp nhiều khó khăn do chủng biểu hiện A. oryzae và vector biểu hiện trong chủng A. oryzae không đƣợc thƣơng
mại hóa trên thị trƣờng. Do đó, chủng nấm men P. pastoris là chủng an toàn trong thực phẩm đƣợc chọn để thay thế cho chủng nấm sợi A. oryzae. Vấn đề gặp phải chỉ số phù hợp codon (CAI) của gen trong chủng chủ thấp và tỷ lệ các bộ mã hiếm trên gen cao, do đó để có thể biểu hiện tốt trong chủng nấm men P. pastoris, gen mã hóa cho asparaginase của A. oryzae cần phải đƣợc thay thế các mã bộ ba hiếm thành các bộ có tần số sử dụng tốt trong nấm men P. pastoris nhƣng khơng làm thay đổi trình tự amino acid.
Trong nghiên cứu này gen mã hóa asparaginase của nấm men A. oryzae đƣợc cải biến 13 mã bộ ba hiếm để phù hợp cho việc biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris và trong trình tự gen chúng tôi đƣa thêm vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI và NotI ở hai đầu gen, tạo điều kiện cho việc đƣa gen vào vector pPIC9. Gen
cải biến đƣợc đặt tên là asp1 và đƣợc hãng Genscript tổng hợp, tách dòng trong vector pUC57.
Hình 5. Sơ đồ tóm tắt q trình thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện gen asp1
trong tế bào nấm men P. pastoris SMD1168
Sau khi nhận đƣợc vector tách dịng mang gen, chúng tơi đã tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp pUC-asp1 vào tế bào E. coli DH10b để nhân dòng gen với số lƣợng lớn. Sau đó, gen asp1 từ pUC-asp1 và vector biểu hiện pPIC9 đƣợc cắt bằng enzyme XhoI và NotI và đƣợc tinh chế lại, tiến hành nối ghép tạo vector pPIC-asp1. Sản phẩm nối ghép đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH10b để chọn dòng tế bào mang pPIC-asp1. Để định hƣớng plasmid pPIC-asp1 tích hợp vào hệ gen của P. pastoris, pPIC-asp1 đƣợc cắt mở vòng bằng enzyme StuI trên vùng gen HIS4 và
biến nạp vào tế bào nấm men P. pastoris bằng phƣơng pháp xung điện. Các dòng tế bào nấm men P. pastoris tái tổ hợp đƣợc nuối cấy trên môi trƣờng chọn lọc khuyết
dƣỡng histidin. Sau khi nhận đƣợc các thể biến nạp, chúng tơi lựa chọn các dịng tái tổ hợp có kiểu hình Mut+
để tiến hành biểu hiện gen trong các chủng nấm men này có bổ sung methanol 0,5% trong vịng 72 giờ để biểu hiện gen asparaginase. Tồn bộ quá trình thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen asp1 trong nấm men P. pastoris đƣợc trình bày ở hình 5.
3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN ASPARAGINASE CỦA A. ORYZAE 3.1.1. Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu hiện asparaginase tái tổ hợp 3.1.1. Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu hiện asparaginase tái tổ hợp
Hình 6. Đồ thị dự đốn sự có mặt, vị trí và điểm cắt tín hiệu tiết có trong asparaginase của A. oryzae
Gen asparaginase của A. Oryzae dài 1137 nucleotide mã hóa protein gồm 378 amino acid. Tuy nhiên, protein đƣợc tổng hợp từ chủng tái tổ hợp A. oryzae có khả năng bị cắt ở đầu N ở bốn vị trí khác nhau, cho ra protein với bốn đầu N bị cắt cụt ở các vị trí amino acid thứ 27, 30, 75 và 80 nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc hoạt tính sinh học của enzyme. Vì vậy kích thƣớc của asparaginase có hoạt tính sinh học nằm trong khoảng từ 31,5-37 kDa [10]. Để biểu hiện gen asparaginase của A. oryzae
trong nấm men và tiết thành công sản phẩm protein ra ngoại bào tạo thuận tiện cho quá trình thu hồi enzyme, các trình tự tín hiệu tiết khơng đặc hiệu cần phải đƣợc loại bỏ bởi vì chúng có thể làm giảm hiệu quả quá trình tiết sản phẩm protein ra ngoại bào. Tín hiệu tiết này đƣợc chúng tơi dự đốn bằng phần mềm Predisi (prediction of signal peptides). Kết quả cho thấy, đoạn đầu N có chứa trình tự tín hiệu và có điểm cắt đoạn tín hiệu tiết ở vị trí amino acid thứ 19 (Hình 6). Do vậy, để loại bỏ tín hiệu tiết này đồng thời làm giảm khả năng bị cắt sau khi tổng hợp nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc hoạt tính sinh học của aspraginase, chúng tơi đã quyết định loại bỏ đoạn trình tự gồm 90 nucleotide đầu tiên tƣơng ứng với vị trí cắt thứ hai ở amino acid thứ 30 bao gồm cả tín hiệu tiết nguyên thủy của gen và vị trí cắt khơng đặc hiệu trên asparaginase. Vì vậy, đoạn gen asp đƣợc biểu hiện trong đề tài có trình tự từ nucleotide 91-1137 (Hình 7). 91 – TCGAACGTCACCTATGTGTTCACCAACCCCAAT 123 GGCCTGAACTTTACTCAGATGAACACCACCCTGCCAAACGTCACTATCTTCGCGACAGGC 183 GGCACAATCGCGGGCTCCAGCGCCGACAACACCGCAACAACAGGTTACAAAGCCGGTGCA 243 GTCGGCATCCAGACACTGATCGACGCGGTCCCGGAAATGCTAAACGTTGCCAACGTCGCT 303 GGCGTGCAAGTAACCAATGTCGGCAGCCCAGACATCACCTCCGACATTCTCCTGCGTCTC 363 TCCAAACAGATCAACGAGGTGGTCTGCAACGACCCCACCATGGCCGGTGCAGTGGTCACC 423 CACGGCACCGACACGCTCGAAGAATCCGCCTTCTTCCTCGACGCCACGGTCAACTGTCGC 483 AAGCCCGTGGTCATCGTCGGCGCCATGCGCCCTTCAACCGCCATCTCGGCTGACGGCCCC 543 CTCAACCTCCTGCAATCCGTCACCGTCGCCGCGAGCCCCAAGGCCCGAGACCGCGGCGCC 603 CTGATTGTCATGAACGACCGCATCGTATCCGCCTTCTACGCCTCCAAGACGAACGCCAAC 663 ACCGTCGATACATTCAAGGCCATCGAAATGGGTAACCTGGGCGAGGTCGTCTCCAACAAA 723 CCCTACTTCTTCTACCCCCCAGTCAAGCCAACAGGCAAGACGGAAGTAGATATCCGGAAC 783 ATCACCTCCATCCCCAGAGTCGACATCCTCTACTCATACGAAGACATGCACAATGACACC 843 CTTTACTCCGCCATCGACAACGGCGCAAAGGGCATCGTTATCGCCGGCTCCGGCTCCGGC 903 TCCGTCTCCACCCCCTTCAGCGCCGCCATGGAAGACATCACAACCAAACACAACATCCCC 963 ATCGTAGCCAGCACGCGCACCGGAAACGGGGAGGTGCCGTCCTCCGCCGAGTCGAGCCAG 1023 ATCGCAAGCGGGTATTTGAACCCCGCAAAGTCACGCGTTTTGCTTGGCTTGTTGCTTGCC 1083 CAGGGGAAGAGTATTGAGGAAATGAGGGCGGTTTTTGAGCGGATTGGGGTTGCTTGA 1137
Hình 7. Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến và biểu hiện trong nấm
men P. Pastoris
3.1.2. Cải biến sơ bộ gen asparaginse
Trƣớc khi cải biến gen, trình tự gen ban đầu đƣợc phân tích sơ bộ bằng cơng cụ phân tích mã bộ ba hiếm (Rare codon analysis tool, Genscript). Công cụ này cho phép đánh giá khả năng biểu hiện của gen ngoại lai asp của A. Oryzae trong chủng chủ P. pastoris thông qua chỉ số codon phù hợp (CAI – codon adaptation index). Ngồi ra, việc phân tích gen bằng cơng cụ này cịn cung cấp thêm bảng phân bố các
codon của gen ứng với tần suất sử dụng của nó trong chủng chủ, đề ra những hƣớng ban đầu để cải biến gen.
Khi phân tích khả năng biểu hiện của gen asp trong hệ biểu hiện P. pastoris bằng cơng cụ phân tích mã bộ ba hiếm Genescript, chúng tôi thấy rằng hệ số mã bộ ba phù hợp của gen asp của A. oryzae trong P. pastori là 0,58 và có 13 codon chiếm 3% có tần suất sử dụng tƣơng đối dƣới 20 thuộc các mã hiếm nằm ở các vị trí nucleotide số 85, 103, 178, 391, 421, 484, 505, 532, 688, 889, 967, 1021, 1033, cịn số codon có tần suất sử dụng dƣới 30 lên tới 32 mã tƣớng ứng với 9% gen (Hình 8).
Hình 8. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định biểu
hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ mức độ phù hợp của các bộ mã trên asp so với bộ mã trong chủng biểu hiện P. pastoris (B)
Nhƣ vậy, chỉ số CAI dƣới 0,6 và tỷ lệ codon có tần suất sử dụng tƣơng đối thấp giá trị dƣới 30 có thể lên tới gần 10% đã cho thấy khả năng biểu hiện kém hiệu quả của gen asp trong chủng nấm men P. pastoris. Do đó, để tăng cao mức độ biểu