1.3.4 .Kỹ thuật ngưng kết
1.7. Điều trị và dự phòng
Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis
Loài Lây truyền Bệnh Điều trị Ngăn ngừa Chẩn đốn phịng thí nghiệm Neisseria -Nước bọt - Viêm màng não - Hội chứng Waterhouse- Friderichsen - Penicillin G - Cefotaxime - Ceftriaxone - Vắc xin NmVac4- A/C/Y/W- 135 - Rifampin
- Kính hiển vi: song cầu khuẩn; gram (-), trong hoặc ngoài tế bào. - Nuôi cấy thạch chocolate agar, oxidase (+) lên men glucose và maltose trong 5% CO2.
Những người được khẳng định nhiễm N. meningitidis sẽ được nhập
viện ngay để điều trị kháng sinh. Bởi vì bệnh viêm màng não có thể diễn biến rất nhanh, sử dụng một liều kháng sinh tiêm bắp nhanh nhất có thể, thậm trí trước khi nhập viện, nếu hội chứng bệnh đầy đủ. Kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (cefotaxime, ceftriaxone) được sử dụng khi nghi ngờ hoặc nuôi cấy chứng minh là nhiễm trước cả khi có kết quả nhậy cảm kháng sinh. Trên kinh nghiệm điều trị cần xem xét cẩn thận chọc đốt sống thắt lưng để thu thập dịch não tủy gửi tới phịng thí nghiệm (khơng được chọc ống sống trước thời gian bệnh nhân nhập viện 30 phút). Kết quả điều trị kháng sinh dựa vào kết quả thử nghiệm về vi khuẩn học, nhưng chẩn đoán dựa trên cơ sở nuôi cấy máu và kiểm tra về mặt lâm sàng. Các phương pháp xác định tính nhạy cảm kháng sinh, dựa trên kỹ thuật pha loãng định lượng hoặc khuếch tán định lượng trên đĩa thạch. Các phương pháp dựa trên một loạt các nồng độ pha lỗng gấp đơi của các kháng sinh trong dung dịch hoặc trên đĩa thạch. Các phương pháp này tạo các giá trị MIC. Giá trị MIC khơng tồn tại một cách chính xác và MIC
“thực sự” nằm giữa nồng độ thấp nhất mà ức chế sự phát triển của VSV và nồng độ thấp hơn nồng độ đó. Thậm trí, trong điều kiện kiểm sốt tốt nhất, một thử nghiệm pha lỗng khơng đưa ra cùng một giá trị điểm cuối tại mỗi thời điểm thực hiện[]
Etest là kỹ thuật định lượng xác định tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). Các vi khuẩn khó mọc
* Dự phịng
Kháng sinh:
Toàn bộ những người tiếp xúc với bệnh nhân trên 7 ngày trước khi bệnh khởi phát sẽ tiếp nhận thuốc dự phòng để ngăn ngừa việc phơi nhiễm do tiếp xúc. Đối tượng ở đây là trẻ vị thành niên hoặc người chăm sóc bệnh nhân hoặc trẻ nhỏ trong trường mẫu giáo, bất kỳ người nào ngủ hoặc ở với bệnh nhân cùng nhà trong 7 ngày trước khi bệnh nhân có triệu chứng khởi phát bệnh hoặc người nằm sát bệnh nhân trong một chuyến bay hoặc phòng họp kéo dài trong thời gian 8 giờ, sẽ được tiếp nhận dự phòng bằng kháng sinh, thuốc thường được lựa chọn là rifamicin trong thời gian vài ngày.
Vắc xin
Năm 2008; Mỹ sử dụng 03 liều vắc xin dự phịng cho tồn bộ trẻ em dưới 2 tuổi, hiệu quả 03 liều tiêm bảo vệ được nhóm huyết thanh: A, C, Y và W135. Vắc xin conjugate (MCV4) tiêm đã được cấp phép lưu hành ở Mỹ năm 2005, và năm 2010. Vắc xin này sử dụng cho người ở lứa tuổi từ 2-55 tuổi và nó có biểu hiện đáp ứng miễn dịch kém. Vắc xin Polysacchride (MPSV4) đã được sử dụng từ năm 1970, đối tượng là người từ 2-55 tuổi, nếu MCV4 vắc xin không mua được hoặc cấm dùng. Năm 2012; FDA – Mỹ, phê chuẩn vắc xin kết hợp chống lại não mô cầu và Hib cho trẻ em và trẻ từ 6 tuần đến 18 tháng tuổi. Vắc xin Menhibrix được thiết kế ngăn ngừa nhóm huyết
thanh C và Y và Hib. Năm 2014; FDA cấp phép cho vắc xin chống lại nhóm huyết thanh B tên là Trumenba, sử dụng cho trẻ từ 10-25 tuổi.
Khu vực châu Phi, dự án vắc xin não mô cầu giới thiệu một loại vắc xin có tên MenAfriVac ở Châu Phi do Viện huyết thanh học của Ấn Độ giá 50 USD/ mũi tiêm, bắt đầu ở Burkina Faso năm 2010, sử dụng 215 triệu người dọc theo Bê - nanh; Camaron, Benin, Cameroon, Chad, IvoryCoast, Ethiopia, Ghana, Mali, Niger, Mauritania, Nigeria, Senegal, Sudan, Togo và Gambia. Năm 2015 không ghi nhận ca bệnh viêm màng não ở người đã tiêm vắc xin. Tháng 8 năm 2015 Tổ chức y tế thề giới cho phép menAfriVac sử dụng thường qui cho chương trình miễn dịch ở Châu Phi.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng
Thu thập 209 mẫu nhầy họng (lấy ngẫu nhiên mỗi trung đoàn 30 người, với tiêu chuẩn: tuổi quân trên 6 tháng, ưu tiên người có hội chứng viêm đường hô hấp cấp, loại trừ các trường hợp đã dùng kháng sinh trong thời gian 01 tháng, tính đến thời điểm giám sát).
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1.Thiết bị
+ Máy điều nhiệt Techne (UK)
+ Hệ thống điện di và soi gel – Bio rad + Máy định danh vi khuẩn Vitek (Pháp)
2.2.2. Sinh phẩm
- Mơi trường phân lập:
+ Thạch chocolate có kháng sinh VCN + Thạch máu
+ Bộ thuốc nhuộm gram.
+ Sinh phẩm định danh vi khuẩn Gram (-) NH- Biomerius ( Pháp) + Thanh E-test xác định MIC của vi khuẩn ( Pháp)
- Sinh phẩm khảo sát gene đích: + Taq PCR mastermix (Qiagen) + Sinh phẩm tách ADN từ khuẩn lạc:
a. Tris- HCl buffer (10 mM,pH : 8,0) f. Tris-HCL b. Lysis buffer (4% SDS, 10 mM EDTA, pH: 8,0) g. EDTA c. Mutanolysin enzyme h. Triton X-100 d. Hyaluronidase enzyme i. silicon dioxide
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang.
- Cơng thức tính cỡ mẫu:
2 2 2 / 1 ) 1 ( d p p Z n
Trong đó, α = 0,05 thì Z1 – α/2 = 1,96, p = 16,42 (theo kết quả nghiên cứu năm
2012)[3]. Số mẫu lý thuyết: n = 206, số mẫu thực tế: N = 209.
2.3.2. Phương pháp thực nghiệm trong phịng thí nghiệm:
Hình 2.1 : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis
2.3.2.1. Kỹ thuật phân lập, định danh vi khuẩn
(1) Thu thập mẫu nhầy họng bằng tăm bông cán mềm.
(2) Cấy nhầy họng trên mơi trường chocolate có kháng sinh VCN
Sơ đồ nghiên cứu
(3) Vận chuyển các đĩa thạch từ thực địa về phịng thí nghiệm bằng chng thủy tinh có nến, sau đó để ở tủ ấm có 5% khí CO2 ở nhiệt độ 370
C.
(4) Quan sát hình thể khuẩn lạc, lựa chọn khuẩn lạc trịn vồng nhẹ, xám nhạt, khơng có mùi đặc biệt, khơng gây tan huyết môi trường nuôi cấy.
(5) Nhuộm gram: Ở dạng song cầu hình hạt đậu hay hạt cà phê xếp úp vào nhau, bắt màu Gram (-).
(6) Kết hợp với định danh vi khuẩn: bằng thẻ định danh NH trên máy Vitek®2
Thống kê các tính chất sinh hóa trên phiếu định danh máy Vitek®2 (Bao gồm 30 tính chất sinh hóa trong thẻ ) và các tính chất bổ sung theo yêu cầu.
Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH
Giếng Tính chất Tên viết
tắt
Hàm lƣợng/ giếng
1 Arginine ARYLAMIDASE ArgA 0,0324 mg
2 GAMMA-GLUTAMYL-
TRANSFERASE
GGT 0,0228 mg
3 L-Lysine-ARYLAMIDASE LysA 0,0228 mg
4 D-GALACTOSE dGAL 0,3 mg
5 Leucine ARYLAMIDASE LeuA 0,023 mg
6 ELLMAN ELLM 0,03 mg
7 Phenylalanine ARYLAMIDASE PheA 0,026 mg
8 L-Proline ARYLAMIDASE ProA 0,023 mg
10 L-Pyrrolidonyl-ARYLAMIDASE PryA 0,018 mg
13 Tyrosine ARYLAMIDASE TryA 0,0279 mg
18 D-GLUCOSE dGLU 0,3 mg 19 GLYCOGENE GLYG 0,18 mg 20 D-MANNOSE dMNE 0,3 mg 22 D-MALTOSE dMAL 0,3 mg 28 SACCHAROSE/SUCROSE SAC 0,3 mg 33 N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE NAG 0,3 mg 36 UREASE URE 0,15 mg 39 BETA-GALACTOPYRANOSIDASE Indoxyl BGALi 0,006 mg
40 ORNITHINE DECARBOXYLASE ODC 0,15 mg
41 ALPHA-ARABINOSIDASE AARA 0,0324 mg 45 PYRUVATE PVATE 0,15 mg 46 PHOSPHORYL CHOLINE PHC 0,0366 mg 47 D-MALATE dMLT 0,15 mg 51 MALTOTRIOSE MTE 0,3 mg 52 L-GLUTAMINE IGLM 0,15 mg 59 PHOSPHATASE PHOS 0,05 mg 61 D-RIBOSE dRIB 0,3 mg 62 Phenylphosphonate OPS 0,024 mg 64 D-XYLOSE dXYL 0,3mg
Kỹ thuật định danh vi khuẩn trên máy Vitek:
Nguyên lý kỹ thuật: Máy định danh tự động là hệ thống có khả năng theo dõi sự phát triển liên tục của vi sinh vật trong các giếng có sẵn trong thẻ
định danh; dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hố học của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng mơi trường. Máy có phần mềm xử lí và phân tích tính chất sinh hóa của chủng vi khuẩn nuôi cấy và tự động đọc kết quả.
Phương pháp đo màu của máy dựa trên nguyên lí sự suy giảm cường độ sáng: Hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng.
Chủng định danh cần phải qua bước nuôi cấy phân lập và làm thuần trước đó. Trước khi đặt mẫu vào máy cần phải thực hiện các bước cơ bản bao gồm: 1) Pha khuẩn lạc vào tube chứa nước muối NaCl 0,45%, tạo huyền dịch vi khuẩn;
2) Đặt tube và thẻ định danh lên giá đỡ;
3) Đặt giá vào buồng hút, các bước tiếp theo máy sẽ thực hiện trong chu trình khép kín và trả lời kết quả sau 4 - 6h, tùy loại vi khuẩn.
- Ưu điểm của máy định danh tự động là cho kết quả nhanh, độ nhậy đạt 96 – 99%, đối với não mô cầu là 96,8%.
2.3.2.2.Kỹ thuật xác định nhóm huyết thanh của N. meningitidis bằng
kỹ thuật Multiplex-PCR.
Qui trình tách DNA từ khuẩn lạc đối với vi khuẩn Gram (-)
1. Lấy 1,0 ml dung dịch NMSL vào tube nhựa loại 1,5 ml.
2. Sử dụng pipette pasteur hoặc tăm bông lấy vi khuẩn đã được nuôi cấy sau 18-24 giờ cho vào dung dịch NMSL, votex .
3. Rửa khuẩn vi khuẩn 2 lần bằng NMSL (0,8%), tạo dung dịch treo, ly tâm 10.000 rpm/5 phút, ly tâm bỏ nước nổi và thu cặn.
4. Cho vào tube 1 ml dung dịch đệm 10mM tris (pH:8,0), đồng nhất mẫu bằng votex. Đo nồng độ vi khuẩn (tương đương 3,0 McFaland).
5. Sử dụng giấy paraphin quấn quanh đầu tube, đánh số thứ tự (không nhầm mẫu), đun sôi dung dịch treo ở 100oC/10 phút (thời gian tính từ lúc nước ở 100oC).
6. Ly tâm 12.000 rpm/ 5 phút, thu nước nổi chuyển sang tube khác. 7. Thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc bảo quản ở -20oC.
Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện nhóm huyết thanh của
N. meningitidis từ chủng vi khuẩn đƣợc định danh
- Trình tự các cặp mồi cho multiplex - PCR: Thiết kế các cặp mồi dựa trên trình tự đã biết của gene orf-2 (A) và siaD (xác định B, C, W135, Y). Mồi do hãng Invitrogen sản xuất có trình tự như sau:
Trình tự Vùng gen khuếch đại (lồi, nhóm)
Kích thước
(bp) Tm
5’-cgcaataggtgtatatattcttcc-3’ orf-2 (A)
400 53,1 5’-cgtaatagtttcgtatgccttctt-3’ 55 5’-ggatcatttcagtgttttccacca-3’ siaD (B) 450 60,9 5’-gcatgctggaggaataagcattaa-3’ 60,4 5’-tcaaatgagtttgcgaatagaaggt-3’ siaD (C) 250 59,2 5’-ca atcacgatttgcccaattgac-3’ 62,2 5’-cagaaagtgagggatttccata-3’ siaD (W135) 120 54,7 5’-cacaaccattttcattatagttactgt-3’ 54,1 5’-ctcaaagcgaaggctttggtta-3’ siaD (Y) 120 59,5 5’-ctgaagcgttttcattataattgctaa-3’ 58,2
- Thành phần tham gia phản ứng Multiplex - PCR
Thành phần phản ứng multiplex-PCR Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng
Nước 2,5 -
5x Q-solution 2,5 1x
Primer orf-2 (Ar) (20 µM) 0,25 0,2 µM
Primer orf-2 (Af) (20 µM) 0,25 0,2 µM
Primer siaD (Br) (20 µM) 0,25 0,2 µM Primer siaD (Bf) (20 µM) 0,25 0,2 µM Primer siaD (Cr) (20 µM) 0,25 0,2 µM Primer siaD (Cf) (20 µM) 0,25 0,2 µM Primer siaD (W135r) (20 µM) 0,25 0,2 µM Primer siaD (W135f) (20 µM) 0,25 0,2 µM
Primer siaD (Yr) (20 µM) 0,25 0,2 µM
Primer siaD (Yf) (20 µM) 0,25 0,2 µM
Multiplex Master mix, 2x 12,5 1x
AND đích 5
Tổng 25
- Chu trình nhiệt: cho phản ứng khuyếch đại được tiến hành trên máy điều
nhiệt Techne (Anh).Giai đoạn 1: 940C/ 10’ với 1chu kỳ; Giai đoạn 2: 940
C/ 30” ; 600C/ 45”; 720C/ 30” với 35 chu kỳ; Giai đoạn 3: 720C/ 10’; 40
C - ∞; -Sản phẩm PCR được đọc trên máy đọc UV, bước sóng 320 nm
Khảo sát gene đích phát hiện N. meningitidis và nhóm huyết thanh :
Xác định tần suất xuất hiện các vùng gene bảo thủ đặc hiệu phát hiện N.
meningitidis. Các thông tin và qui trình kỹ thuật áp dụng dựa trên các bài báo
đã được đăng trên tạp chí chuyên ngành. Các cặp mồi sử dụng đã được kiểm tra và so sánh trên ngân hàng gene NCBI để xác định vị trí, kích thước sản phẩm. Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là TaqPCR master Mix (Qiagen- Đức). Các vùng gene: CtrA; PorA; CrgA; sodC được lựa chọn để khảo sát
N.meningitidis và gene Osurf được sử dụng để khảo sát nhóm huyết thanhA;
gene siaD được sử dụng để khảo sát nhóm huyết thanh B và C.
Trên cơ sở khảo sát vùng gene đặc hiệu với các chủng vi sinh vật tuyển chọn được từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân bằng kỹ thuật định danh là cơ sở cho việc lựa chọn vùng gene bảo thủ tương ứng phục vụ cho việc xây dựng sinh phẩm mPCR phù hợp với chủng lưu hành ở Việt Nam.
Bảng 2.2: Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và
các nhóm huyết thanh (A; B; C)
STT Tên vi khuẩn Tên primers Oligolucleotids sequencing ( 5’- 3’) Sản phẩm (bp) Tác giả và bài báo 1 N. menin gitidis
CtrA (1F) gct gcg gta ggt ggt tca a
110 bp CtrA (1R) ttg tcg cgg att tgc aac ta
CtrA (2f) CtrA (2r)
tag ggt gtt caa cgg caa at 306bp aat ggc gta tag cgg aac ac
CrgA (1f) cgt aat cgc cag tcc tga at 393 bp CrgA (1r) ttg ttt ccc agt tcc tcc ac
CrgA (2F) gct ggc gcc gct ggc aac aaa att c 230 CrgA (2R) ctt ctg cag att gcg gcg tgc cgt
sodC (f 351) gca cac tta ggt gat tta cct gca t 127 sodC (r 478) cca ccc gtg tgg atc ata ata ga
2
Sero- A Orf-2 (1F) cgc aat agg tgt ata tat tct tcc 400 Orf-2 (1R) cgt aat agt tcc gta tgc ctt ctt
Sero- B siaDb (1F) gga tca ttt cag tgt ttt cca cca 450 siaDb (1R) gca tgc tgg agg aat aag cat taa
Sero- C SiaDc (1F) tca aat gag ttt gcg aat aga agg t 250 SiaDc (1R) caa tca cga ttt gcc caa ttg ac
Ghi chú: Điều kiện tối ưu cho mỗi phản ứng PCR sẽ được trình bày ở kết quả
2.3.2.3. Kỹ thuật đánh giá tình trạng kháng kháng sinh của các nhóm huyết thanh
Thử nghiệm invitro: Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu kháng
sinh (MIC) bằng thanh giấy tẩm kháng sinh – E test (Epsilonmeter test).
Nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh (Minimun Inhibitor Concentration –MIC) là nồng độ nhỏ nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh invitro, trước
đây người ta thường sử dụng phương pháp pha loãng định lượng kháng sinh trên môi trường nuôi cấy với nguyên lí: Cho nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và bằng mắt thường có thể quan sát thấy được điều này. Nhược điểm của các kĩ thuật này là cho kết quả lâu, thiếu sự ổn định, phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm người thực hiện. Sự ra đời của kĩ thuật xác định MIC bằng E test là một bước đột phá trong y học.
Nguyên lý kỹ thuật : E test là kĩ thuật định lượng xác định tính nhạy cảm của kháng sinh và MIC (µg/ml); là sự kết hợp của các ngun lí pha lỗng và khuếch tán trong thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Thay vì cơng đoạn pha lỗng các nồng độ kháng sinh khác nhau trong mơi trường như trước đây, người ta đã tạo ra một thanh giấy E test tẩm sẵn kháng sinh, kháng sinh cần thử nghiệm theo các gradien nồng độ (µg/ml) khác nhau (hình 2.2). Khi thanh E test được đặt trên bề mặt đĩa thạch đã ria bệnh phẩm, kháng sinh trên thanh ngấm nhanh vào đĩa thạch (theo Gradien nồng độ đã xác định trước). Sau khi ủ một thời gian, theo điều kiện nuôi cấy của từng loại vi khuẩn, có thể quan sát thấy sự phát triển của vi khuẩn là một hình elip với vùng ức chế đối xứng ở trung tâm dọc theo thanh. Giá trị MIC được đọc từ tỷ lệ µg/ml là giao của hình elip và thanh Etest (Hình 2.3).
Hình 2.2. Thanh E test Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và
chuẩn thức phịng thí nghiệm (CLSI) năm 2013[]
Kháng sinh Ký hiệu Nồng độ Kích thƣớc vịng vơ khuẩn (mm) Nhận định MIC (µg/ml) S I R S I R Penicillin PG - - - ≤ 0,06 0,12-0,25 ≥ 0,5 Ampicillin AM - - - ≤ 0,12 0,25-1 ≥ 2 Ceftriaxone CRO hoặc TX 30 µg ≥ 34 ≤ 0,12 - -