theo trung đoàn
Đơn vị Mẫu (n) NMC (%) Nhóm huyết thanh B C A/W13 5 /Y Khác X e141 (1) 30 13 (43,33%) 13 (100%) 0 0 0 e165 (2) 30 11 (36,66%) 6 (54,55%) 5(45,45% ) 0 0 (0%) e209 (3) 29 18 (62,06%) 15(83,33%) 0 0 3 (16,67%) Y e101(4) 30 13 (43,33%) 13(100%) 0 0 0 (0%) e18 (5) 30 8 (26,66%) 8(100%) 0 0 0 e95 (6) 30 8 (26,66%) 8(100%) 0 0 0 Z d11 (7) 30 7(23,33%) 4 (57,14%) 0 0 3 (42,86%) P(3;1) ≥ 0,05; P (3;2) < 0,05; P (2;1) ≥ 0,05 ; P (4,5,6,7) ≥ 0,05. P (1b;3b) ≥ 0,05; P (1b;3bvà 2b;4b;5b;6b;7b) < 0,05
Bảng 3.6 cho thấy:
Tỷ lệ người mang mầm bệnh cao ở các trung đoàn thuộc đơn vị X (thấp nhất là e 165: 36,66%, cao nhất ở e 209: 62,06%). Tỷ lệ người mang mầm bệnh của các trung đoàn thuộc Y (thấp nhất là e18: 26,66%, cao nhất là e101: 43,33%).Tuy nhiên, chúng tôi thấy tại e141 (f312) và e18, e95 (f325) 100% các chủng đều là nhóm huyết thanh B gây bệnh, do vậy, những đơn vị này cần phải hết sức đề phòng nguy cơ dịch xảy ra. Tại e209 và e101 tỷ lệ nhiễm N. meningitidis cao hơn các đơn vị khác, lần lượt là: 62,06 % và 43,33%. Tuy
nhiên, vẫn cịn tỷ lệ khơng nhỏ 53,84% (e101) và 28,57% (e209) có sự lưu hành của nhóm huyết thanh khác. Trong giám sát này chúng tôi sử dụng kỹ thuật multiplex PCR xác định 5 nhóm huyết thanh gây bệnh chủ yếu, do đó khơng loại trừ được khả năng có sự lưu hành các nhóm huyết thanh khác. Nghiên cứu mới đây cho thấy, nhóm huyết thanh X, K, Z cũng có khả gây bệnh nhưng với tỷ lệ thấp [8]. Điều này phù hợp với nhận định trước đây khi chẩn đốn ca bệnh dương tính với N. meningitidis trong dịch não tủy, nhưng khơng xác định được nhóm huyết thanh bằng multiplex PCR. Cơ cấu nhóm huyết thanh theo trung đoàn chủ yếu là nhóm huyết thanh B, riêng e165 có thêm nhóm huyết thanh C. Sau nhiều năm, nhóm huyết thanh C lần đầu tiên phát hiện trong quân đội từ vụ dịch tại d11 - f363 năm 2012. Năm 2013 phát hiện thêm 01 trường hợp tại e 165 - f312 [4]. Trong đợt giám sát này, tại e 165 đã xác định 5 trường hợp mang nhóm huyết thanh C.
Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo địa phương nhập ngũ
Quê quán Số mẫu (n) NMC ( %) Nhóm huyết thanh B C W135/Y Khác Hưng Yên 59 20 (33,89%) 20 0 0 0 Nam Định 54 28 (51,85%) 25 1 0 2 Ninh Bình 22 8 (36,36%) 5 2 0 1 Hà Nam 14 7 (50,00%) 4 2 0 1 Hải Dương 14 3 (21,42%) 3 0 0 0 Hải Phòng 10 2 (50,00%) 1 0 0 1 Khác 36 10 (27,77%) 9 0 0 1 Tổng 209 78 67 5 0 6
Ghi chú: Các tỉnh khác bao gồm Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nội, Nghệ
An, Quảng Ninh, Thái Bình, Thanh Hố và Vĩnh Phúc
Tỷ lệ quân nhân nhập ngũ từ các địa phương thuộc các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ từ 27,77% - 51,85%. Cơ cấu nhóm huyết thanh B lại khá phổ biến ở quân nhân có nguồn gốc từ Nam Định và Hưng Yên (42,59% và 65,00%). Kết quả này khơng phản ánh chính xác tỷ lệ nhiễm của thanh niên tại địa phương, nhưng phần nào gợi ý đến sự lưu hành của N. meningitidis với nhóm huyết
thanh mang tính chất địa phương. Để trả lời câu hỏi này cần giám sát thanh niên trước nhập ngũ.
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và
cơ cấu nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật Multiplex-PCR
TT Ký hiệu chủng Định danh, độ tin cậy (%) PCR phát hiện Serogroups TT Ký hiệu chủng Định danh, độ tin cậy (%) PCR phát hiện serogroups 1 Nm A QT N. meningitidis A 35 14153 97% N. meningitidis B 2 Nm B QT N. meningitidis B 36 14156 95% N. meningitidis C 3 Nm C QT N. meningitidis C 37 14157 97% N. meningitidis C 4 Nm Y QT N. meningitidis Y 38 14031 97% N. meningitidis B 5 NmW 135 QT N. meningitidis W 135 39 14072 99% N. meningitidis B 6 Nm X QT N. meningitidis X 40 14075 99% N. meningitidis B 7 14000 97% N. meningitidis B 41 14062 99% N. meningitidis B 8 14001 95% N. meningitidis B 42 14196 99% N. meningitidis B 9 14002 97% N. meningitidis B 43 14089 98% N. meningitidis B 10 14003 97% N. meningitidis B 44 14120 98% N. meningitidis B 11 1004 95,0% N. meningitidis B 45 12 14006 99% N. meningitidis B 46 14064 99% N. meningitidis B 13 14007 99% N. meningitidis B 47 14175 97% N. meningitidis B 14 14008 99% N. meningitidis B 48 14102 98% N. meningitidis B 15 14020 99% N. meningitidis B 49 14207 99% N. meningitidis B 16 14022 99% N. meningitidis B 50 14197 99% N. meningitidis B 17 14044 97% N. meningitidis B 51 14155 98% N. meningitidis C 18 14127 99% N. meningitidis B 52 14173 99% N. meningitidis C 19 14142 99% N. meningitidis B 53 14152 97% N. meningitidis C 20 14021 95% N. meningitidis B 54 14072 99% N. meningitidis B
21 14039 93% N. meningitidis B 55 14144 95% N. meningitidis B 22 14113 96% N. meningitidis B 56 14046 93% N. meningitidis B 23 14138 95% N. meningitidis B 57 14128 98% N. meningitidis B 24 14208 97% N. meningitidis B 58 14167 97% N. meningitidis B 25 14124 97% N. meningitidis B 59 14207 99% N. meningitidis B 26 14158 97% N. meningitidis B 60 14160 97% N. meningitidis B 27 14206 97% N. meningitidis B 61 14184 93% N. meningitidis B 28 14145 95% N. meningitidis B 62 14153 97% N. meningitidis B 29 14143 95% N. meningitidis B 63 14076 95% N. meningitidis B 30 14193 97% N. meningitidis B 64 14039 95% N. meningitidis B 31 14188 95% N. meningitidis B 65 14201 95% N. meningitidis B 32 14200 97% N. meningitidis B 66 14208 96% N. meningitidis B 33 14198 97% N. meningitidis B 67 14184 93% N. meningitidis B 34 14192 95% Không xác định
Ghi chú: *chủng từ bệnh nhân, QT: chủng quốc tế
Kết quả bảng trên cho thấy:
Kết quả định danh vi khuẩn gram (-), với Oxidase (+) trên thanh NH với 30 tính chất chuyển hóa axit amin và đường cho phép chẩn đoán
N.meningitidis với độ tin cậy từ 95% - 99%. Kỹ thuật định danh trên thanh
NH áp dụng đối với vi khuẩn lây nhiễm đường hô hấp trên máy Vitex 2 có độ chính xác cao hơn các kỹ thuật kinh điển trước đây là xác định 4 tính chất lên men đường: glucose (+), maltose (+), lactose và schaccarose (-) và ngưng kết với kháng huyết thanh kháng polysacchride của N. meningitidis mới cho phép chẩn đoán sơ bộ. Nhận định kết quả dương tính hay âm tính với lồi phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của kháng huyết thanh do các công ty sản xuất với độ tinh sạch khác nhau, đôi khi phản ứng ngưng kết không đặc hiệu vẫn xảy ra do:
- Chất lượng của kháng huyết thanh, độ đặc hiệu của kỹ thuật. - Do nhận định chủ quan của người làm kỹ thuật và đọc kết quả.
Trong nghiên cứu này việc xác định cơ cấu nhóm của N. meningitidis
bằng kỹ thuật mPCR cho thấy các chủng phân lập từ bệnh nhân (mẫu: DNT, máu, ban hoại tử…) và nhầy họng của người mang mầm bệnh không triệu chứng chủ yếu là nhóm B và thấp hơn là sự lưu hành của nhóm C, chưa thấy phát hiện ở các nhóm khác trong 12 nhóm huyết thanh của N. meningitidis.
(Phiếu định danh N. meningitidis trong phần phụ lục).
3.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học phân tử của các chủng
N.meningitidis phân lập được bằng các cặp mồi đặc hiệu lồi và nhóm N.meningitidis thông qua phản ứng PCR
Lựa chọn 32 trong tổng số 61 chủng đã phân lập được ở trên tiến hành khảo sát đặc điểm sinh học phân tử bằng các cặp mồi đặc hiệu cho lồi và nhóm N.meningitidis
Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện loài N. meningitidis
- Vùng gene ctrA là vùng gene có tính bảo thủ cao và thường được sử
dụng trong các phản ứng PCR và realtime-PCR để xác định N.meningitidis,
đây là vùng gene mã hóa vỏ capsule, tuy nhiên ở người mang mầm bệnh
không triệu chứng, tỷ lệ khơng có gene này lên đến 16%.
Dưới đây là một số thông tin về các cặp mồi, quy trình PCR được lựa chọn trong nghiên cứu cũng như một số kết quả khảo sát sự xuất hiện của
gene ctrA trên các chủng N.meningitidis đã phân lập được
+ Cặp mồi W135663/W139969 [31]
Kết quả so sánh trên ngân hàng gene [phụ lục 1]
Kết quả Blast trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi) giữa AF315863.1 (Query ) GU391296.1 (Sbjct) thì có 1 số khác nhau về trình tự, đúng vào vị trí bắt cặp của mồi Neisseria meningitidis strain M4440 CtrA gene.
Cặp mồi Wl35663/ Wl38969, khơng trùng 100% với trình tự của Neisseria meningitidis.
+ Tiến hành phản ứng PCR trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập
Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no GU391296
GTCGCGGTGATGTGGTTA AATCTCTGCCTCACTGCCAT
+ Kết quả PCR
Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis
Kết quả cho thấy 32 chủng N. meningitidis đã phân lập đều cho kết quả dương tính. Chưa tìm thấy chủng N. meningitidis thiếu gene ctrA
+ Cặp mồi (1F/1R)
Kết quả so sánh trên ngân hàng gene [phụ lục 2]
Kết quả Blast trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) giữa AF315863.1 (Query ) GU391296.1 (Sbjct) thì có 1 số khác nhau về trình tự, rơi đúng vào vị trí bắt cặp của mồi Neisseria meningitidis strain M4440 (ctrA) gene
+ Tiến hành phản ứng PCR trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập
Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no AF315863.1 GU391296.1
GCTGCGGTAGGTGGTTCAA TGTCGCGGATTTGCAACTA 18 19 20 21 22 23 24 25 M 26 27 28 29 30 31 32 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 1314151617 18 257bp
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis
Kết quả cho thấy 31/32 chủng N. meningitidis đã phân lập cho kết quả
dương tính. Có 1 chủng được xác định là khơng có gene ctrA. + Cặp mồi CtrA (2F/2R): [41]
Kết quả so sánh trên ngân hàng gene [phụ lục 3]
Kết quả Blast trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) giữa AF315863.1 (Query ) GU391296.1 (Sbjct) thì có 1 số khác nhau về trình tự, rơi đúng vào vị trí bắt cặp của mồi.
+Tiến hành phản ứng PCR trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập
Trình tự mồi (5’-3’) trên acc.no
Taggtggttcaacggcaaat aatggcgtatagcggaacac
2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M 25 26 27 28 29 30 31
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gen ctrA trên 32 chủng
N. meningitidis
Kết quả cho thấy 31/32 chủng N. meningitidis đã phân lập cho kết quả
dương tính. Có 1 chủng được xác định là khơng có gene ctrA.
- Vùng gene PorA là một loại kháng nguyên phân biệt phân nhóm huyết thanh. Là vùng gene cũng được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới lựa chọn để xác định N. meningitidis
+ Cặp mồi wl-40218 / Wl-40170: [31]
Kết quả so sánh trên ngân hàng gene [phụ lục 4]
+ Tiến hành phản ứng PCR trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập
Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no AY319969
CTCATAGCCGCCCGTCA GCGGTTTTGCCGGGAACTAT
1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, M 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3 31
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.4: Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng
N. meningitidis phân lập được
- Vùng gene CrgA của N. meningitidis mã hóa LysR điều hịa, nó ngược với gene mdaB. Nghiên cứu sao chép giữa hai gene CrgA và mdaB chỉ ra có sự trùng khớp nhau và có hướng phân tách, kiểm sốt sự sao chép của nhau. Sự biến mất của gene CrgA dẫn đến làm tăng sự sao chép từ PcrgA [43]
+ Kết quả so sánh trên ngân hàng gene [phụ lục 5]
+Tiến hành phản ứng PCR trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no AY319969
Gctggcgccgctggcaacaaaattc cttctgcagattgcggcgtgccgt
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 1718 19,20,21,22,23,24,25, 26 M 27 28 29 30 31 32
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32
- Vùng gene SodC: đây là gene điều hòa thay đổi ion Cu, Zn và muối
Ca, nó khơng thuộc vùng gene mã hóa capsule, thử nghiệm trên gene SodC để phát hiện khả năng hình thành vỏ của cầu khuẩn (encapsuleated), nhưng nó có vùng đặc hiệu cho não mô cầu trên người bệnh và nhất là ở người mang mầm bệnh không triệu chứng mà ở đó khơng có gene CtrA, đó là lý do cần thiết gene SodC bổ xung trong việc phát hiện N. meningitidis.
+ Cặp mồi khảo sát theo tác giả:[21]
Kết quả so sánh [phụ lục 6]
+ Tiến hành phản ứng PCR trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập
Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no
GCA CAC TTA GGT GAT TTA CCT GCA T CCA CCC GTG TGG ATC ATA ATA GA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 M 28 29 30 31 32 (-)
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis
Kết quả khảo sát sự xuất hiện của gene Sod C trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập cho thấy có 4/32 chủng khơng thấy xuất hiện band ở vị trí đặc hiệu, điều này chứng tỏ co 4/32 chủng khơng có gene Sod C
Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện nhóm N. Meningitidis
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm A của N. meningitidis [31].
+Tiến hành phản ứng PCR trên 32 chủng N. meningitidis đã phân lập Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no
TTTTATTCTTAGATGTTGACGTTTT ATGCCAGAAATGTTTAGGAGTT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M 25 26 27 28 29 30 31 32
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.7 : Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A,
Bằng việc chạy PCR với cặp mồi phát hiện N. meningitidis nhóm A trên
32 chủng đã phân lập cho thấy khơng có mẫu não dương tính với N. meningitidis nhóm A
Khảo sát sự có mặt của gene siaDb phát hiện nhóm B của N. meningitidis
+ Kết quả so sánh trên ngân hàng gene [phụ lục 7]
+ Thực hiện phản ứng PCR:
Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no NC_003112
TTTTTAGCATATTCAGGAAAGG TTCAATGTGGTTGACAAC ATC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24 25 26 M 27 28 29 30 31 32
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.8: Khảo sát gene siaDb phát hiện N. meningitidis nhóm B
Kết quả bảng trên cho thấy: khảo sát sự xuất hiện của gene siaDb trên
tổng số 32 chủng N. meningitidis 10 dương tính với N. meningitidis nhóm B
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm huyết thanh C của N. meningitidis [31]. + Thực hiện phản ứng PCR Thành phần Trình tự mồi (5’-3’) trên acce.no NC_008767 Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng Sản phẩm (bp) Nước cất khử ion 6,5 381bp wl-37469 TGTGCTAATCCCGCCTGA 0,5 0,2µM Wl-37470 AGAAAGCCGGGAATCGTT 0,5 0,2µM Taq PCR-Master 12,5 Template 5 µl Tổng 25 µl
Chu kỳ nhiệt: Chu kỳ nhiệt: Chu kỳ nhiệt: 950C/5 phút; 30 chu kỳ (950C/30 giây, 560
C/ 45 giây ;720C/1 phút), 720C/5 phút,40C-∞
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324 M 25 26 27 28 29 30 31
+ Kết quả của phản ứng PCR
Hình 3.9: Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm C
Loại trừ những chủng đã dương tính với N.meningitidis nhóm B, tất cả những chủng cịn lại được sử dụng để khảo sát sự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm C của N.meningitidis, kết quả cho thấy có 5 chủng dương tính với
N.meningitidis nhóm B
3.2. Đánh giá sự nhậy cảm với kháng sinh của các chủng N.
meningitidis nhóm huyết thanh B và C
Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis,
nhóm huyết thanh B (n=23)
Kháng sinh Nhạy cảm (S) Trung gian (I) Kháng (R)
Số chủng % Số chủng % Số chủng % Ampicillin 03 13% 20 87% 0 0 Ciprofloxacin 23 100 % 0 0 0 0 Ceftriaxone 23 100 % 0 0 0 0 Rifampin 22* 100 % 0 0 0 0 Benzyl Penicillin 0 0 12 52,17% 11 47,83% Chloramphenicol 10 43,47 % 0 0 13 56,52%
Ghi chú: MIC: minimum inhibator concentration
Kết quả bảng 3.13 cho thấy: Thử nghiệm MIC đối với Ampicillin và
Benzyl penicillin thuộc nhóm ß- Lactam (cùng nhóm với Amoxicllin đang được sử dụng dự phòng cho đơn vị) trên invitro cho thấy:
+ Ampicillin: Chủng N. meningitidis, nhóm huyết thanh B đã có biểu
hiện kém nhậy cảm (giới hạn trung gian-I) 87% các chủng phân lập được. + Benzyl Penicillin: nhóm huyết thanh B trung gian 52,17% và kháng là: 47,83%
Thử nghiệm MIC với nhóm quinolon thế hệ II (Ciprofloxacin) và Rifampin (Rifamicin) và Ceftriaxon thuộc nhóm Cephalosporin thế hệ III: 100% chủng NMC nhóm huyết thanh B cịn nhậy cảm.
Thử nghiệm MIC đối với Chloramphenicol: 10/23 chủng còn nhậy cảm (43,47%) và 13/23 chủng đã kháng (56,52%).
Để đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi sinh vật, trên thế giới áp dụng 02 phương pháp chính:
1) Xác định nhạy cảm theo kiểu hình (trực tiếp xác định độ nhậy cảm trên các chủng vi sinh vật bằng phương kỹ thuật khoanh giấy trên thạch dinh dưỡng, hoặc thanh kháng sinh do các hãng sản xuất);
2) Xác định kháng thuốc kiểu gene (xác định codon đột biến kháng kháng
sinh tương ứng).
Năm 2008; Viện VSPDQĐ đã gửi 02 chủng N. meningitidis, nhóm huyết thanh B sang phịng thí nghiệm của WHO đặt tại PHARO - Cộng Hòa Pháp, kết quả thử nghiệm MIC cho biết các chủng cịn nhậy cảm với ß- Lactam và kháng với Choloramphenicol và Cotrimoxazonle[].
Năm 2013, Viện VSPDQĐ đã gửi 03 chủng N. meningitidis, nhóm huyết thanh B phân lập trong vụ dịch tại e 209 sang Bệnh Viện bệnh nhiệt đới Trung ương, kết quả thử nghiệm bằng E-test cho thấy: Các chủng đã giảm nhậy với Ampicillin, Penicillin và kháng với Chloramphenicol,
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm