CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu
Đối với các phƣơng pháp sắc ký, nền mẫu và quy trình xử lý mẫu có ảnh hƣởng lớn đến kết quả của phƣơng pháp, đặc biệt là với các đối tƣợng mẫu phức tạp nhƣ dịch sinh học. Do đó, để tiến hành định lƣợng PQ trong huyết tƣơng bằng HPLC có kết quả tốt cần xây dựng một quy trình xử lý phù hợp.
Sau khi tham khảo một số tài liệu [7][17][24][30] và dựa vào các điều kiện hiện có, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch TCA, thời gian lắc xoáy.
3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch TCA
Trong nghiên cƣ́ u này, chúng tôi nghiên cứu xác định nồng độ PQ trong mẫu huyết tƣơng, là dung dịch mẫu có nền phức tạp và khó đốn định . Trong đó chủ yếu là các loại protein. Để viê ̣c đi ̣nh lƣợng PQ có kết quả tốt và bảo vê ̣ cô ̣t sắc ký và kéo dài tuổi thọ của cột cần phải loại protein ra khỏi nền mẫu . Qua tham khảo mô ̣t số tài liê ̣u cho thấy a cid trichoroacetic (TCA) là chất thƣờng đƣợc sử dụng để kết tủa protein trong các di ̣ch sinh ho ̣c. Vì vậy, chúng tơi sử dụng TCA để loại protein trong nghiên cƣ́u này . Tuy nhiên, nồng đô ̣ TCA ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình tách và làm sạch dung dịch mẫu . Do đó cần khảo sát để cho ̣n điều kiê ̣n tối ƣu nồng đô ̣ TCA trong quá trình xƣ̉ lý mẫu.
Trong thí nghiê ̣m này , chúng tôi lựa chọn nồng độ TCA trong khoảng 2,0% v/v tớ i 6,0% v/v. Quy trình xƣ̉ lý mẫu sau : Lấy 1,00 ml mẫu huyết tƣơng đã thêm chất ch̉n PQ với nờng đơ ̣ 5,00 µg/ml sau đó cho 1 ml TCA với các nồ ng đô ̣ khác nhau. Hỗn hợp đƣơ ̣c đem lắc xoáy trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Dung dịch phía trên đƣợc lo ̣c và đem đi phân tích . Kết quả xác đ ịnh lại nồng độ PQ trong mẫu thêm chuẩn bằng phƣơng pháp đƣờng chuẩn thu đƣợc trong bảng 3.12
Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của nồng độ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi huyết tƣơng Nồng đô ̣ TCA
(%) Nờng đơ ̣ PQ (µg/ml) Độ thu hồi (%) RSD (%) 2,0 4,89 97,8 2,20 4,0 4,93 98,6 1,40 5,0 4,99 99,8 0,20 6,0 4,99 99,8 0,20
Với 1 ml nồng độ dung dịch acid trichloroacetic 5,0 % qua khảo sát đã loa ̣i bỏ đƣợc hết protein trong huyết tƣơng , dƣ lƣơ ̣ng trong mẫu nhỏ , ít ảnh hƣởng đến đƣờng nền nhất và ít pha loãng mẫu.
3.2.2. Khảo sát thời gian lắc xoáy
Thời gian lắc xoay cũng ảnh hƣởng tới quá trình tách các chất nền ra khỏi mẫu. Do đó cần phải cho ̣n thời gian lắc xoáy tối ƣu để kết quả đƣợc tớt nhất .
Quy trình xử lý mẫu sau: Lấy 1ml mẫu huyết tƣơng đã thêm chất ch̉n PQ với nờng đơ ̣ 5,00 µg/ml sau đó cho 1 ml dung di ̣ch TCA nồng đô ̣ 5 %. Hỗn hợp đƣợc đem lắc xoáy trong 0,5; 1; 2 phút, sau đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Dung dịch phía trên đƣợc lọc và đem đi phân tích. Kết quả thu đƣợc trong bảng 3.13:
Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của thời gian lắc xoay đến q trình chiết Thời gian lắc xoáy
(phút) Nờng đơ ̣ PQ (µg/ml) Độ thu hồi (%) RSD (%) 0,5 4,91 98,2 1,8 1,0 4,99 99,8 0,2 2,0 4,99 99,8 0,2
Thời gian lắc xoáy sau khi khảo sát ở các thời gian 30 giây; 1,0 phút và 1,5 phút thì chúng tơi chọn thời gian là 1 phút. Vì khi tiến hành thí nghiệm với thời gian 30 giây độ thu hồi của PQ thấp hơn, cịn ở 1 và 1,5 phút khơng có sự khác biệt.
Nhƣ vậy, quy trình xử lý mẫu PQ huyết tƣơng đƣợc tiến hành nhƣ trong hình 3.14:
Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết tƣơng
Dịch lọc Chạy sắc ký
1 ml huyết tƣơng
Hỗn dịch
Dung dịch trong
+ Ly tâm 15 phút (4000 vịng/phút) + Lấy dịch trong phía trên
+ 1 mL TCA 5 %
+ Lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm
Hình 3.15: Sắc ký đờ PQ trong huyết tƣơng chuẩn áp du ̣ng quy trình xƣ̉ lý mẫu hình 3.14
3.2.3 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích
Chuẩn bị 3 mẫu nhƣ trên, lấy 1 phần mẫu ra xử lý ngay, phần còn lại bảo quản ở -20oC trong 21 ngày. Lấy các mẫu đang bảo quản ra xử lý và tiến hành sắc ký trong các ngày thứ 7, 14 và 21.
Bảng 3.14: Kết quả xác đi ̣nh đô ̣ ổn đi ̣nh khác ngày Ngày Mẫu 0 7 14 21 RSD (%) 1 2,00 1,98 1,96 1,95 1,06 2 2,01 1,98 1,97 1,95 1,11 3 2,01 1,97 1,97 1,95 1,11
Nhận xét thấy, các giá trị RSD nhỏ (< 2%) chứng tỏ phƣơng pháp này có độ tái lặp tƣơng đới tớt và giá tr ị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu sau nhiều ngày kể tƣ̀ khi lấy mẫu.