CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
Theo nhƣ tính chất đã biết của paraquat dichloride là tan tốt trong nƣớc và ít tan trong dung môi hữu cơ nhƣ EtOH, MeOH… Tham khảo các tài liệu và so sánh về độ phân cực của nƣớc và các dung môi, chúng tôi lựa chọn nƣớc để hịa tan PQ vì nƣớc khơng độc hại, thân thiện với môi trƣờng hơn EtOH, MeOH.
2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương
Dựa theo tính chất lý hóa của PQ, theo các tài liệu đã công bố và trang thiết bị phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành khảo sát các điều kiện để tách PQ từ huyết tƣơng nhƣ sau:
Với 1 ml mẫu huyết tƣơng, thêm dung dịch TCA đ ể loại protein, lắc xoáy và ly tâm với nồng độ dung di ̣ch TCA th ay đổi là: 2,0%; 4,0%; 5,0%; 6,0% và thời gian lắc xoáy: 30 giây, 1 phút, 2 phút.
2.3.1.3. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương
Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tƣơng, các mẫu chuẩn chiết PQ trong nền mẫu đƣợc chuẩn bị bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc ký. Dựa trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo.
* Cột sắc ký: Cột tách có vai trị quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay khơng [3]. Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Dựa trên khảo sát các tài liệu tham khảo và điều kiện cơ sở vật chất sẵn có tại Trung tâm Chống độc, chúng tơi sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm) trong nghiên cứu này.
* Bƣớc sóng (λ): là cực đại hấp thụ của PQ trong mẫu thử, xác định cực đại hấp thụ của PQ dựa vào phổ hấp thụ UV trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD.
* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl.
* Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ pha động có khả năng tách, thời gian lƣu phù hợp và cho các pic cân đối thuận lợi cho phân tích định lƣợng gồm các hệ pha động sau:
- Hệ A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M trong nƣớc và kênh 2 là dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol. Tốc độ dịng 0,5 ml/phút. Tỷ lệ thể tích 2 kênh tƣơng ứng là 90 : 10.
- Hệ B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH = 3 (10:90, v/v). Thành phần đệm gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nƣớc khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine.
- Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nƣớc xấp xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH bằng H3PO4 đặc. Định mức vƣ̀ a đủ 1000 ml bằng nƣớc deion.
* Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi pha động phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần của pha động. Giá trị pH pha động cũng đƣợc khảo sát trong khoảng từ 2,5 đến 4,5.
* Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri heptanesulfonate, KCl & polyethylenglycol.
* Tốc độ dòng: thay đổi tốc độ pha động từ 0,2 - 0,8 ml/phút để xác định đƣợc tốc độ phù hợp cho một thời gian lƣu tối ƣu.
* Các kết quả thu đƣợc ứng với từng khảo sát đƣợc đánh giá, so sánh về thời gian lƣu của các chất phân tích (tR), độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS). Phƣơng pháp đánh giá này dựa trên lý thuyết Van Deemter sao cho 0,9 < AS < 1,2, tR của các chất phải không quá lớn nhƣng đảm bảo phải tách xa nhau.
2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương
2.3.2.1. Tính chọn lọc
Chuẩn bị mẫu huyết tƣơng trắng khơng có PQ và mẫu huyết tƣơng trắng có PQ. Tiến hành xử lý và phân tích mẫu, đánh giá hiệu quả tách PQ ra khỏi nền mẫu.
2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính
Chuẩn bị các mẫu huyết tƣơng trắng, thêm PQ để thu đƣợc các mẫu chuẩn có nồng độ PQ từ 0,02 - 10 µg/ml. Chúng tơi xây dựng đƣờng chuẩn với 8 nồng độ PQ đƣợc them vào mẫu huyết tƣơng trắng lần lƣợt là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và 10 µg/ml. Sau đó xử lý mẫu và tiến hành phân tích.
2.3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Tiến hành xử lý các mẫu huyết tƣơng trắng và mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 0,01 - 0,1 µg/ml và phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ lệch chuẩn của phƣơng trình hồi quy và xác định LOD theo quy tắc 3ϭ, LOQ theo quy tắc 10 ϭ.
2.3.2.4. Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)
- Độ đúng: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tƣơng trắng ở 5 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký rồi so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lƣợng của mỗi nồng độ với giá trị chất thêm vào trong mẫu.
- Độ lặp lại:
+ Độ lặp lại trong ngày: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tƣơng trắng ở 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký nhƣ phần độ đúng, đánh giá độ lệch chuẩn tƣơng đối của các mẫu theo từng nồng độ.
+ Độ lặp lại khác ngày: tiến hành tƣơng tự nhƣ trên nhƣng làm ở 5 ngày khác nhau.
2.3.2.5. Độ ổn định
Xác định độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gian phân tích và thời gian bảo quản.
- Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu PQ nồng độ 1 µg/ml trong huyết tƣơng, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ mỗi giờ 1 lần trong vòng 5 giờ, xác định RSDr.
- Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu nhƣ trên, lấy 1 phần ra xử lý và tiến hành sắc ký ngay, phần còn lại bảo quản ở -30oC trong 21 ngày. Lấy các mẫu đang bảo quản ra để xử lý và tiến hành sắc ký ngay vào các ngày thứ 7, 14 và 21.
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ
2.3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2015.
Chẩn đốn ngộ độc PQ dựa vào: bệnh nhân có 1 trong 2 tiêu chuẩn: - Bệnh nhân uống thuốc trừ cỏ PQ và có biểu hiện lâm sàng ngộ độc PQ. - Xét nghiệm định tính độc chất nƣớc tiểu tìm thấy PQ.
2.3.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
- Bệnh nhân có tiền sử bệnh phổi, thận, gan.
- Những bệnh nhân ngộ độc đồng thời các chất độc khác.
Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca bệnh. Tiến hành nghiên cứu:
* Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án (theo đánh giá của bác sĩ điều trị):
- Tên loại thuốc trừ cỏ có PQ, hàm lƣợng PQ trong thuốc trừ cỏ, lƣợng PQ uống, thời gian đến viện, thời gian bắt đầu điều trị.
- Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng. - Điều trị lọc máu hấp phụ đƣợc áp dụng.
- Các điều trị khác: than hoạt, ức chế miễn dịch, liệu pháp lipid.
Các số liệu này đƣợc dùng trong đánh giá hiệu quả điều trị và mức độ nhiễm độc * Lấy mẫu định lƣợng PQ huyết tƣơng khi vào viện, trƣớc và sau các lần lọc máu hấp phụ:
- Tiến hành lấy máu bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai ngay vào viện khi đƣợc chẩn đoán xác định ngộ độc PQ. Các bệnh nhân lọc máu hấp phụ đƣợc lấy máu ngay trƣớc và sau lọc. Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy huyết tƣơng.
- Mẫu huyết tƣơng đƣợc xử lý và phân tích bằng phƣơng pháp HPLC đã xây dựng. Mỗi mẫu đƣợc phân tích lặp lại 3 lần (n=3), tính kết quả trung bình. Phƣơng pháp định lƣợng là phƣơng pháp đƣờng chuẩn.
- Kết quả nồng độ PQ trong mẫu (µg/ml) trong dung dịch thử đƣợc tính dựa vào đƣờng chuẩn.
* Thu thập kết quả điều trị. Tỷ lệ tử vong tại viện, sau 3 tháng: ghi số điện thoại của BN và ngƣời nhà, gọi điện thoại xác định tình trạng BN sống/tử vong sau 3 tháng.
Các chỉ số nghiên cứu chính:
* Tỷ lệ tử vong sau 3 tháng
* Nồng độ PQ huyết tƣơng khi vào viện, dùng nồng độ này tính điểm SIPP sửa đổi (severity index of PQ poisoning: chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ) – liên quan tỉ lệ tử vong.
SIPP = [nồng độ PQ huyết tƣơng (àg/ml)] ì [thi gian t khi ung n bt u định lƣợng (h)]
* Hiệu quả lọc PQ của lọc máu hấp phụ (HP) (dựa vào nồng độ PQ huyết tƣơng trƣớc và sau các lần lọc máu hấp phụ)
*Xử lý số liệu: bằng phần mềm SPSS for Windows 16.0. Số liệu đƣợc trình
bày dƣới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn, hoặc trung vị và tứ phân vị nếu phân bố không chuẩn, đánh giá giá trị tiên lƣợng tử vong của nồng độc Paraquat vào viện bằng cách tính diện tích dƣới đƣờng ROC, so sánh giá trị nồng độc Paraquat giá trị trƣớc sau điều trị bằng test Wilcoxon.