a: pH=4,5; b: pH=4,0; c: pH=3,5; d: pH=3,0; e: pH=2,5 Bảng 3.3: Ảnh hƣở ng của pH tới thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic
pH Thời gian lƣu
(phút) AS 2,50 11,89 0,870 3,00 12,75 - 3,50 12,36 - 4,00 12,90 0,280 4,50 12,69 0,360
“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu.
Từ kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH pha động ở bảng trên, chúng tôi nhận thấy: Tại giá trị pH = 2,5, pic sắc nét và khá ổn định. Thời gian lƣu thấp hơn so với các giá trị pH khác, hệ số đối xứng và độ phân giải tƣơng đối ổn định. Khi pH tăng, các pic bị tách đỉnh dẫn tới pic không cân đối và độ rộng pic lớn, do ion PQ2+
bị chuyển thành dạng PQ(OH)2 (N+ trong phân tử PQ kết hợp với OH-) trong dung dịch pha động, vì vậy làm giảm khả năng tạo cặp ion với C7H15SO3- và khả năng hấp thụ ánh sáng của PQ.
Do đó, để các pic tách nhau rõ ràng, tiết kiệm thời gian phân tích, và bảo vệ tuổi thọ của cột, chúng tôi chọn pH=2,5 cho pha động và giữ ổn định cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.6. Khảo sát thành phần dung dịch đệm
Sau khi chọn đƣợc pH của dung dịch đệm, chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của các chất trong dung dịch đệm. Thành phần của các chất trong dung dịch đệm khác nhau thì khả năng tách chất của pha động là khác nhau. Do đó thành phần của dung dịch đệm ảnh hƣởng rất lớn tới quá trình rƣ̉ a gi ải chất phân tích ra khỏi cột. Vì vậy, phải tối ƣu hóa nồng độ các chất trong dung dịch đệm để sự tách hiệu quả hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn khảo sát 3 yếu tố chính: natriheptanesulfonate, PEG và KCl.
3.1.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natriheptanesulfonate
Trong nghiên cứu này, chất phân tích PQ là một cation, do đó natri heptanesulfonate đƣợc sử dụng để tạo cặp ion với chất phân tích PQ. Liên kết này giúp cho chất phân tích đƣợc giữ lại trong cột mà không bị rửa giải ngay sau khi đƣơ ̣c bơm vào c ột. Nồng độ của natri heptanesulfonate ảnh hƣởng lớn tới hiệu quả tách và thời gian lƣu của chất, do đó phải khảo sát và chọn nồng độ tối ƣu. Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong khoảng 1 tới 1,25 %. Các khảo sát đƣợc thực hiện ở điều kiện : sử dụng pha động là ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu là 30 µl.
Hình 3.8: Sắc đờ khảo sát nờng đơ ̣ của natriheptanesulfonate trong đê ̣m pH 2,5 a: 1,00 mg/m; b: 1,05 mg/ml; c: 1,10 mg/ml; d: 1,15 mg/ml; e: 1,20 mg/ml Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồng độ natriheptanesulfonate đến thời gian lƣu, hệ số đối
xứng pic Nồng đô ̣
(mg/ml)
Thời gian lƣu
(phút) AS 1,00 10,74 0,67 1,05 10,86 1,01 1,10 11,89 0,87 1,20 12,06 2,72 1,25 11,86 0,89
Khi tăng nồng độ của natri heptanesulfonate thời gian lƣu của PQ giảm tuy nhiên sự thay đổi này là không dáng kể. Khi nồng độ thay đổi tử 1,00 mg/ml tới 1,20 mg/ml, thời gian chênh nhau khoảng 1 phút lần lƣợt từ 10,74 phút đến 12,06 phút. Trong khi đó, hình dạng của các pic chất thay đổi rất lớn khi thay đổi khoảng nhỏ nồng độ của natri heptanesulfonate. Khi nồng độ ion C7H15SO3- thấp, các ion PQ2+ không đƣợc tạo cặp liên hợp ion hoàn toàn làm cho khả năng rửa giải PQ của
phƣơng pháp kém, tín hiệu quang thấp, các pic chất bị dỗng và không cân đối nhƣ hình 3.8 a và b. Nhƣng khi nồng độ của ion âm quá cao, làm cho phức hợp mang điện tích âm nên hiệu quả rửa giải thấp, pic chẻ và dỗng chân nhƣ hình 3.8 d, e. Tại nồng độ 1,10 mg/ml hình dạng pic là cân đối sắc nét nhất, độ phân giải của pic tƣơng đối tốt, thời gian lƣu của PQ khơng q dài (hình 3.8 c). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dung dich đệm 1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, pH = 2,5 cho các bƣớc tiếp theo.
3.1.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ KCl
Sau khi chọn đƣợc nồng độ natri heptanesulfonate phù hợp 1,1 mg/ml, chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của KCl trong pha động. Chƣơng trình rửa giải đẳng dịng đã đƣợc sử dụng và pha động ACN - đệm (5:95, v/v) với tốc độ dịng 0,5 ml/phút, nồng độ 5 µg/ml PQ, thể tích tiêm mẫu là 30 μl. Dung dịch đệm bao gồm: 1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, nồng độ KCl trong khoảng từ 1 mg/ml tới 3 mg/ml, 0,2%(v/v) PEG, 0,05% triethylamine và 20%(v/v) MeOH.
Hình 3.9: Sắc đờ của PQ khi thay đổi nồng đô ̣ của KCl trong pha động. a: 1,0 mg/ml; b: 1,5 mg/ml; c: 2,0 mg/ml; d: 2,5 mg/ml; e: 3,0 mg/ml
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nồng độ KCl đến thời gian lƣu và hệ số đối xứng pic. Nồng đô ̣ Thời gian lƣu AS
(mg/ml) (phút) 1,00 13,54 1,19 1,50 13,21 3,23 2,00 11,88 0,87 2,50 9,76 0,8 3,00 9,16 0,67
Từ kết quả ở bảng 3.5 và các sắc đồ trong hình 3.9, nhận thấy: Khi tăng nồng độ của KCl thì thời gian lƣu của PQ giảm. KCl đƣợc dùng để tạo môi trƣờng điện ly cho dung dịch đệm do đó khi tăng nồng độ chất điện ly này làm các chất mang điện dễ hòa tan trong dung dịch pha động hơn làm cho chất phân tích bị rửa giải nhanh hơn . Tại nồng độ 1,00; 1,50; 2,50 mg/ml các pic chất xấu và không cân đối. Tại nồng độ 2,0 mg/ml hình dạng các pic tƣơng đối cân xứng, độ phân giải các pic chất tốt. Tuy nhiên, tại nồng độ 3,00 mg/ml đƣờng nền xấu và khơng ổn định. Vì vậy chúng tơi chọn nồng độ KCl 2,00 mg/ml cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ PEG
Chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của PEG trong dung dịch đệm. Nồng độ của PEG đƣợc chọn để khảo sát là 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,3 % v/v. Các điều kiện chạy sắc ký bao gồm dung dịch pha động là ACN và dung dịch đệm với tỉ lệ tƣơng ứng là 5 : 95 (v/v) với tốc độ dịng pha động là 0,5 ml/phút, PQ có nồng độ 5 µg/ml, thể tích bơm mẫu là 30 µl. Dung dịch đệm gồm 1,1 mg/ml natri heptanesulfonate, 2 mg/ml KCl, 20% v/v MeOH và các nồng độ khác nhau của PEG, các dung dịch đƣợc điều chỉnh tới pH = 2,50 bằng acid phosphoric.
Hình 3.10: Sắc đờ của PQ khi thay đổi nồng đô ̣ của PEG trong pha động. a: 0,10 %v/v, b: 0,15 %v/v; c: 0,20% v/v; d: 0,25% v/v; e: 0,30 % v/v
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nồng độ PEG đến thời gian lƣu và hệ số đối xứng pic. Nồng đô ̣
(% v/v)
Thời gian lƣu
(phút) AS 0,10 12,68 2,52 0,15 11,02 - 0,20 11,88 0,86 0,25 11,32 - 0,30 10,75 0,99
“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu.
Từ bảng 3.6 và các sắc đồ thu đƣợc, chúng tôi thấy tại nồng độ 0,20 % v/v hình dạng pic là cân đối và sắc nét nhất , hệ số phân giải cao , các pic tách nhau rõ ràng. Vì vậy, chúng tơi chọn nồng độ tối ƣu của PEG là 0,20 % v/v .
3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng
Tốc độ pha động cũng ảnh hƣởng tới hiệu quả tách sắc ký vì nó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong 2 pha tĩnh và pha động. Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích ra muộn, gây dỗng pic, giảm độ nhạy. Khi tốc độ
pha động quá lớn có thể làm cho chất phân tích chƣa tách khỏi nhau đã bị đẩy ra khỏi cột dẫn đến hiện tƣợng chồng pic, gây áp suất lớn trong bơm và tốn dung môi.
Để đảm bảo các điều kiện trên chúng tơi lựa chọn khảo sát tốc độ dịng pha động từ 0,2 - 0,8 ml/phút. Các điều kiện chạy sắc ký bao gồm dung dịch pha động là ACN và dung dịch đệm pH 2,5 với tỉ lệ tƣơng ứng là 5 : 95 (v/v), PQ có nồng độ 5 µg/ml, thể tích bơm mẫu là 30 µl. Bƣớc sóng hấp thụ là 259 nm.
Hình 3.11: Sắc đờ khảo sát tớc đơ ̣ dòng
a: 0,2 ml/phút, b: 0,3ml/phút, c: 0,4 ml/phút, d: 0,5 ml/phút, e: 0,6 ml/phút, f: 0,8ml/phút
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của tốc độ dòng đến thời gian lƣu và hệ số đối xứng pic Tốc đô ̣ dòng
(ml/phút)
Thời gian lƣu
(phút) AS 0,2 30,94 3,29 0,3 20,10 1,84 0,4 15,00 1,51 0,5 11,89 0,87 0,6 9,98 3,04 0,8 7,52 3,54
Từ kết quả thu đƣợc cho thấy, khi tốc độ dòng nhỏ thời gian lƣu lớn, pic không cân đối. Khi tăng quá cao, pic bị kéo đầu dù vẫn tách khỏi nền mẫu. Tốc độ dòng 0,5 ml/phút là tối ƣu vì tách riêng đƣợc PQ khỏi các chất nền trong mẫu sinh học, lại có thời gian phân tích hợp lý, tiết kiệm dung mơi.
Tóm lại điều kiện tối ƣu của q trình tách PQ trên hệ thống HPLC nền mẫu huyết tƣơng nhƣ sau:
- Pha tĩnh: cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm). Nhiệt độ cột: 30oC. Thể tích bơm mẫu 30 µl.
- Pha động: ACN – Đệm (5:95, v/v). Đệm gồm 1,10 g natri
heptanesulfonate; 2,00 g KCl; 2,00 ml polyethylenglycol 400; 0,05% triethylamine; 200 ml MeOH; thêm nƣớc xấp xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH đến 2,5 bằng dung dịch H3PO4 đặc. Định mức vƣ̀ a đủ 1000 ml bằng nƣớc deion.
- Bƣớc sóng: 259 nm (Detetor DAD). - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
3.1.8. Đường chuẩn, giớ i hạn phát hiê ̣n và giới hạn đi ̣nh lượng.
3.1.8.1. Xây dựng đường chuẩn
Các dung dịch dùng để dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha nhƣ mục (mục 2.3.2.2). Nồng độ các dung dịch này đƣợc biểu diễn trong bảng 3.11. Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc sẽ là số liệu để dựng đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.
Hình 3.12: Sắc ký đờ các nồng đô ̣ PQ khác nhau tƣ̀ 0,02 – 10,00 µg/ml Bảng 3.8: Nồng độ và diện tích pic trung bình của PQ
Nờng đơ ̣ PQ (µg/ml) Diê ̣n tích pic (mAU) 0,05 11,24 0,10 19,87 0,50 103,85 1,00 205,90 2,00 410,87 5,00 1027,46 10,00 2050,76
10 8 6 4 2 0 2000 1500 1000 500 0 Nong do PQ (ppm) D ie n ti ch p ic ( m A U)
Duong chuan PQ theo dien tich pic
Hình 3.13: Đƣờng chuẩn PQ theo diện tích pic
Kết quả trên cho thấy, sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PQ có sự tuyến tính trong khoảng từ 0,05 µg/ml đến 10 µg/ml. Trong khoảng nồng độ này, phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng y = 0,84 + 205,06x với hệ số số tƣơng quan R2
= 0,9999. Trong đó y là diện tích pic (mAU), x là nồng độ PQ trong huyết tƣơng.
Độ lệch chuẩn của phƣơng trình : Sy = 0,89. Độ lêch chuẩn của hệ số a : Sa = 0,39
Độ lệch chuẩn của hệ số b: Sb = 0,10 Ta có: ∆𝑎 = 𝑡 𝑃, 𝑓 . 𝑆𝑎 𝑛= 𝑡 0,95, 7 . 𝑆𝑎 𝑛= 2,36 × 0,39 8 = 0,32 ∆𝑏 = 𝑡 𝑃, 𝑓 . 𝑆𝑏 𝑛 = 𝑡 0,95, 7 . 𝑆𝑏 𝑛 = 2,36 × 0,10 8 = 0,08
Phƣơng trình hồi quy đầy đủ có dạng
3.1.8.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
LOD có thể đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc phƣơng trình hồi quy. Trong trƣờng hợp này, khi phân tích mẫu huyết tƣơng trắng khơng xuất hiện pic tại thời gian lƣu của PQ nên có thể xem độ lệch chuẩn của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín hiệu khi phân tích mẫu nền yb = a. Khi đó tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện.
YLOD = a + k.Sy. Với độ tin cậy 95%, k = 3. Sau đó dùng phƣơng trình hồi
quy có thể tìm đƣợc LOD:
xLOD=
Giới hạn định lƣợng (LOQ)
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
YQ = yb + K. Sb
Thơng thƣờng LOQ đƣợc tính với K = 10 tức là CQ = 10.SB/b. Hay S/N = 10 nên suy ra LOQ = 3,33 LOD.
Từ sự phụ thuộc của diện tích pic của PQ vào nồng độ, ta tính đƣợc LOD, LOQ của chất.
b Sy
. 3
Bảng 3.9: Giới ha ̣n phát hiê ̣n và giới ha ̣n đi ̣nh lƣơng của PQ
b Sy LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml)
205,06 0,89 0,013 0,040
Với các giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng tính đƣợc ở trên, khi xử lý mẫu thực cần pha lỗng cho phù hợp để q trình tính tốn kết quả là hợp lý nhất.
3.1.8.3. Đánh giá phương trình đường chuẩn
- Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0
Trong phƣơng trình đƣờng chuẩn y = a + bx, trƣờng hợp lý tƣởng xảy ra khi a = 0. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thƣờng mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a 0. Nếu giá trị a khác khơng có nghĩa thống kê thì phƣơng pháp
phân tích sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trƣớc khi sử dụng đƣờng chuẩn cho phân tích cơng cụ cần kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 khơng có ý nghĩa thống kê khơng.
Bảng 3.10: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phƣơng trình đƣờng chuẩn PQ. Nờng đơ ̣ PQ (µg/ml) y (mAU) b b' 𝑦 = 𝑎 + 𝑏 𝑥 𝑦′ = 𝑏′ 𝑥 0,05 11,24 208,04 224,84 11,02 10,38 0,10 19,87 190,31 198,71 21,19 20,76 0,50 103,85 206,02 207,7 102,61 103,8 1,00 205,90 205,06 205,9 204,38 207,59 2,00 410,87 205,02 205,44 407,91 415,19 5,00 1027,46 205,32 205,49 1018,53 1037,97 10,00 2050,76 204,99 205,08 2036,21 2075,93 Trung bình 203,54 207,59 𝑦𝑖 − 𝑎 − 𝑏 𝑥𝑖 2 305,85 𝑦𝑖 − 𝑏 𝑥′ 𝑖 2 767,08
Kết quả so sánh giƣ̃a giá tri ̣ a và giá tri ̣ 0
Phƣơng sai của 2 phƣơng trình đƣợc tính nhƣ sau:
𝑆𝑦2 = 𝑦𝑖−𝑎−𝑏 𝑥𝑖 2 𝑛 −2 = 𝑦𝑖−0,84−203,54 2 7−2 = 305,85 5 = 61,17 𝑆′𝑦2 = 𝑦𝑖−𝑏 𝑥′ 𝑖 2 𝑛−3 = 𝑦𝑖−207,59𝑥𝑖 2 7−3 = 767,08 4 = 191,77 𝐹𝑡𝑖𝑛 ℎ = Sy 2 S′ y2 = 61,17 191,77 = 0.32 Fbảng : F(0.05, n-3, n-2) = F(0.05, 4, 5) = 5.19
Ta thấy Ftính<Ftra bảng. Vì vậy có thể kết luận đƣợc giá trị a và 0 khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê, hay phƣơng pháp xác định PQ khơng mắc sai số hệ thống.
Khi khơng có sai số hệ thống thì phƣơng trình y = a + bx trở thành phƣơng trình y = b′x, tức là sự khác nhau giữa b và b′ khơng có ý nghĩa thống kê. Do đó có thể dùng chuẩn t để kiểm tra sự khác nhau của 2 giá trị trung bình.
Trƣớc tiên kiểm tra xem 2 phƣơng sai của chúng có đồng nhất khơng, nếu chúng đồng nhất thì ta kết luận ln 2 giá trị b và b′ là khác nhau khơng có nghĩa thống kê, hay chúng giống nhau. Dựa vào phần mềm minitab 16, so sánh 2 giá trị trung bình b và b′. Kiểm tra xem chúng có phƣơng sai tƣơng đồng nhất không.
Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phƣơng trình đƣờng chuẩn của PQ đƣợc chỉ ra ở bảng sau.
Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phƣơng trình đƣờng chuẩn của PQ N=8 Trung bình Độ lệch chuẩn Độ sai chuẩn
b 203,54 5,93 2,24
b' 207,59 8,11 3,07
Sƣ̣ sai khác với đô ̣ tin câ ̣y 95%: (-9,92; 1,81) T- Test = 0; T- Value = -1,69 ; P-Value = 0,142
Nhận thấy Pvalue = 0,142 > 0,05 nên kết luận đƣợc rằng 2 phƣơng sai của b và b’ là khác nhau khơng có nghĩa hay chúng giống nhau. Sử dụng chuẩn t để xem xét tiếp. Tính độ lệch hợp nhất của 2 phƣơng sai trên Spooled của 2 giá trị trên.
𝑆𝑝𝑜𝑜𝑙𝑒𝑑 = 𝑛 𝐴 𝑥𝐴𝑖−𝑥𝐴 2+ 𝑛 𝐵𝑖=1 𝑥𝐵𝑖−𝑥𝐵 2