Khi áp nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) vào điện cực thứ nhất, tại điện cực thứ hai xuất hiện tín hiệu đo ở dạng cƣờng độ dịng điện (I). Vì vậy, dịng điện thu đƣợc tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f.
Vđo = I x Rfeedback
Tín hiệu đầu ra thu đƣợc ở dạng cƣờng độ dịng điện (xoay chiều), sau đó sẽ đƣợc chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vơn thế (xoay chiều), thơng qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại (Rfeedback). Vôn thế xoay chiều sau đó đƣợc chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa trƣớc khi đƣợc hiển thị và lƣu trữ trên máy tính.
Hình 1.8. Q trình chuyển đổi tín hiệu của C4D
Nhƣ vậy, detector đo độ dẫn khơng tiếp xúc ngồi ƣu điểm là phân tích đa năng cịn có lợi thế là khơng nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với dung dịch đo. Đó là do lợi dụng đƣợc tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng. Đây là một cách rất thông minh loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của điện thế cao đến hệ điện tử của detector đảm bảo an tồn và khơng làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích, trong q trình phân tách điện di.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của đề tài là: Nghiên cứu quy trình giám định một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS (gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA) trong mẫu nƣớc tiểu và mẫu bị bắt giữ (Viện Khoa học Hình sự cung cấp) bằng phƣơng pháp điện di mao quản, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE-C4D).
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Trên cơ sở mục tiêu đề ra, nội dung đề tài bao gồm:
- Tổng hợp các tài liệu liên quan đến các chất ma túy tổng hợp nhóm ATS và các phƣơng pháp phân tích.
- Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ƣu cho việc giám định đồng thời 4 chất ma túy tổng hợp nhóm ATS gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D), gồm:
+ Khảo sát hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm. + Khảo sát thời gian bơm mẫu.
+ Khảo sát điện thế đặt vào hai đầu mao quản.
+ Khảo sát sự ảnh hƣởng của các cation đến việc giám định các chất. - Thẩm định, đánh giá phƣơng pháp phân tích
+ Xây dựng đƣờng chuẩn, xác định khoảng tuyến tính (khoảng làm việc). + Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). + Đánh giá độ chụm của phƣơng pháp phân tích.
+ Đánh giá độ đúng của thiết bị và của phƣơng pháp phân tích.
- Áp dụng phân tích hàm lƣợng 04 chất ma túy tổng hợp trong một số mẫu thực tế: mẫu bị bắt giữ và mẫu nƣớc tiểu do Viện Khoa học Hình sự cung cấp.
- Thực hiện phân tích đối chứng một số mẫu có hàm lƣợng các chất ma túy với phƣơng pháp phân tích tiêu chuẩn GC/MS do Viện Khoa học Hình sự thực hiện.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích
Phƣơng pháp phân tích trong luận văn là phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D). Thiết bị này đƣợc thiết kế và chế tạo bởi TS. Mai Thanh Đức và ThS Bùi Duy Anh kết hợp với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (Thụy Sỹ), là thiết bị có nguồn thế cao lên đến 20 kV, có thể thực hiện bán tự động (hình 2.1).
Hình 2.1. Hệ điện di sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc 2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu 2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu
Các mẫu đƣợc sử dụng trong luận văn gồm mẫu viên thuốc bị bắt giữ và mẫu nƣớc tiểu thu đƣợc ở hiện trƣờng các vụ án hoặc tại các trại giam do Viện Khoa học Hình sự cung cấp.
2.2.2.1. Xử lý mẫu viên thuốc
Lấy 1 viên thuốc nghiền thành bột và trộn đều. Cân 1 lƣợng bột chính xác (26,0 mg MA viên; 11,4 mg MA đá; 57,0 mg MDMA viên) trên cân phân tích (độ chính xác 0,1 mg). Sau đó cho vào bình định mức 10,0 mL, thêm 3,0 mL metanol (Riêng MDMA thêm 4 mL methanol vì mẫu này ở dạng bazơ khó tan), siêu âm khoảng 10 phút và định mức tới vạch bằng nƣớc đề ion. Hỗn hợp đƣợc ly tâm (8000 vòng/phút) trong 10 phút, tiếp đến đƣợc lọc qua màng 0,2 µm và pha với tỉ lệ thích hợp bằng nƣớc đề-ion trƣớc khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE.
2.2.2.2. Xử lý mẫu nước tiểu
18 mẫu nƣớc tiểu thu trong vụ “Tổ chức sử dụng trái phép ma túy” đã đƣợc phân tích sàng lọc bằng phƣơng pháp thử miễn dịch (Các mẫu đƣợc đánh số thứ tự từ 1 - 18 ). Kết quả có 12/18 mẫu dƣơng tính ma túy nhóm ATS. Vì hàm lƣợng ma túy trong nƣớc tiểu thƣờng nhỏ nên cần đƣợc chiết xuất để làm giàu mẫu và loại bỏ bớt tạp chất trƣớc khi bơm mẫu vào thiết bị CE. Sau khi tham khảo tài liệu [2, 20] và căn cứ vào các điều kiện thiết bị, hóa chất có trong phịng thí nghiệm, chúng tơi thực hiện qui trình chiết xuất ma túy nhóm ATS trong mẫu nƣớc tiểu nhƣ sau:
1. Lấy mỗi mẫu 5 mL nƣớc tiểu vào ống nghiệm có nắp xốy
2. Kiềm hóa mẫu về pH: 10-11 bằng dung dịch NH3 (kiểm tra bằng giấy quỳ) 3. Chiết mẫu bằng 2 mL etyl axetat, lắc trong vòng 10 phút
4. Ly tâm cho tách lớp
5. Hút lớp etyl axetat (lớp trên) đuổi dung môi, đƣợc cặn chiết
6. Cặn chiết hòa tan vào 100 L methanol rồi tiến hành phân tích trên thiết bị CE-C4D và/hoặc GC-MS.
2.3. Các thơng số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
* Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Đối với các quá trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [13].
* Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Thơng thƣờng, với các quá trình sắc ký giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [13].
2.3.2. Độ chụm ( độ lặp lại) của phương pháp
Độ lặp lại đặc trƣng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi khi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, đƣợc tiến hành bằng một phƣơng pháp phân
tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (ngƣời phân tích, trang thiết bị, phịng thí nghiệm) trong các khoảng thời gian ngắn [13].
Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) theo các công thức sau [10, 13]:
1 2 n S S SD i tb (2.1) ; % x100 S SD RSD tb (2. 2) Trong đó:
- Si là diện tích của pic điện di thứ i - Stb là diện tích trung bình của n lần chạy - n là số lần chạy lặp (n = 6)
2.3.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hay bằng phƣơng pháp xác định độ thu hồi [10, 13]. Độ thu hồi (H): 100 lt tt C C H (2.3) Trong đó:
H: hiệu suất thu hồi (%)
Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu đƣợc (tính theo đƣờng chuẩn) Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính tốn từ lƣợng chuẩn thêm vào. Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lý mẫu ta có độ đúng của phƣơng pháp, cịn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị CE ta có độ đúng của thiết bị. Ngồi ra, độ đúng của phƣơng pháp cịn đƣợc khẳng định qua việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả đo của một phƣơng pháp đối chứng tiêu chuẩn khác.
2.4. Thực nghiệm
2.4.1. Hóa chất
Các hóa chất dùng trong phƣơng pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
2.4.1.1. Chất chuẩn
+ MA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ =66,7%) + MDA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 82,8%) + MDMA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 40,0%) + MDEA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 84,66%)
2.4.1.2. Hóa chất dung mơi
+ L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lƣợng > 99,5%)
+ L- Histidine ( C6H9N3O2) ( Fluka, hàm lƣợng 99,5%) + Axit acetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)
+ Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức) + Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) + Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)
Nƣớc siêu tinh khiết (nƣớc đề-ion): là nƣớc cất hai lần đƣợc lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết với các cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 µm
2.4.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất
* Pha dung dịch chuẩn gốc
Cân riêng từng chất trên cân phân tích (độ chính xác 0,1 mg) MA: 81,8 mg, MDA: 5,0 mg, MDMA: 96,1 mg, MDEA: 11,3 mg đƣợc pha trong dung môi là methanol với lƣợng thích hợp: MA: 3 mL, MDA: 2 mL, MDMA: 4 mL, MDEA: 4 mL, rung siêu âm trong 30 phút, sau đó thêm vào mỗi dung dịch 1 mL nƣớc thu đƣợc các dung dịch gốc có nồng độ tƣơng ứng là MA: 13600 ppm, MDA: 1380 ppm, MDMA:7690 ppm, MDEA: 1910 ppm. Dung dịch đƣợc bảo quản trong tủ lạnh từ 2 - 8oC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vịng 1 năm.
Từ dung dịch chuẩn trên ta có thể pha các dung dịch hỗn hợp 4 chất chuẩn (tỉ lệ nồng độ (ppm) MA : MDA : MDMA : MDEA là 2 : 8,3: 4,2 : 3,7 để làm việc có
các nồng độ khác nhau tƣơng ứng với nồng độ MA là: từ 0,3 – 90 ppm. Các dung dịch làm việc đƣợc pha hàng ngày.
* Pha dung dịch đệm
Các dung dịch đệm điện di đƣợc pha hàng ngày. Chất đệm đƣợc cân và pha trực tiếp vào bình định mức bằng nƣớc đề-ion, sau đó đƣợc rung siêu âm 10 phút và chuẩn lại giá trị pH cần thiết trƣớc khi sử dụng.
2.4.2. Thiết bị dụng cụ
* Thiết bị
- Thiết bị điện di mao quản CE-C4D nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.1. - Máy lọc nƣớc đề-ion của hãng Sientech (Mỹ)
- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521
- Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH
- Cân phân tích của hãng S¢ientech (Mỹ), độ chính xác 0,0001 g - Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu
- Máy ly tâm LCEN-200 * Dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh, pipet, micro pipep.
- Pipetman với các cỡ: 20; 100; 200; 1000 và 5000 µL và đầu típ tƣơng ứng - Các bình định mức nhựa polipropilen (PP) 25 và 100 mL đƣợc sử dụng để pha các dung dịch gốc của các chất phân tích và các dung dịch đệm
- Các lọ Falcon 15 mL, 45 mL và lọ polypropylen (PP) để đựng các dung dịch chuẩn
- Đầu lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,2 µm và 0,45 µm - Các xy lanh có đầu lọc để lọc mẫu
- Mao quản đƣờng kính trong 50 µm, chiều dài 60 cm - Các dụng cụ thông thƣờng khác của phịng thí nghiệm
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu khảo sát để tối ƣu điều kiện tách MA, MDA, MDMA, MDEA
bằng phƣơng pháp điện di mao quản CE-C4D
Việc nghiên cứu khảo sát một số điều kiện tách các chất MA, MDA, MDMA, MDEA đƣợc thực hiện trên hệ thiết bị CE-C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm, đƣờng kính trong 50 µm. Mẫu đƣợc bơm vào mao quản bằng phƣơng pháp thủy động lực học theo kiểu xi phông bằng cách nâng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lên ở độ cao 10 cm so với đầu mao quản còn lại. Độ cao này đƣợc cố định trong tất cả các thí nghiệm.
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm
Trong phƣơng pháp CE, các yếu tố: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm có ảnh hƣởng rất lớn đến dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tốc độ di chuyển phân tử của các chất trong mao quản. Chúng ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng tách các chất trong q trình phân tích. Vì vậy, cần thiết phải khảo sát lựa chọn điều kiện tối ƣu cho các thông số này trong điều kiện cụ thể. Ngoài ra, cần phải khảo sát thêm các yếu tố khác cũng gây ảnh hƣởng đến khả năng tách và/hoặc cƣờng độ tín hiệu nhƣ: thời gian bơm mẫu, thế tách và các chất cản trở khác…
3.1.1.1. Khảo sát thành phần của hệ đệm điện di
Thành phần hệ đệm là một yếu tố có ảnh hƣởng rất nhiều đến khả năng xuất hiện và tách chất trong q trình điện di. Vì vậy, cơng việc quan trọng là tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của hệ đệm. Hệ đệm đƣợc khảo sát gồm một trong hai hợp phần bazơ thƣờng sử dụng trong phƣơng pháp CE-C4
D là Arginine (Arg) (pKa = 9,09) hoặc Histidine (His) (pKa = 8,97), kết hợp với một trong số hợp phần axit thông dụng nhƣ phosphoric (Phos), ascorbic (Asc) hoặc acetic (Ace). Trong đó, hợp phần bazơ đƣợc giữ nguyên nồng độ 10 mM và dùng hợp phần axit để điều chỉnh đến pH mong muốn bằng máy đo pH. Qua tham khảo tài liệu [15] cho thấy giá trị pH = 4,5 là phù hợp để tách các chất. Do đó, việc khảo sát thành phần hệ đệm điện di sẽ đƣợc thực hiện ở pH này.
Quá trình khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di đƣợc thực hiện với các điều kiện sau:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của MA: 40,0 ppm, MDA:
166,5 ppm, MDMA : 83,0 ppm và MDEA : 73,5 ppm trên 4 hệ đệm khác nhau gồm: Arg/Phos, His/Ace, Arg/Asc và Arg/Ace.
- Thế điện di 10 kV, chiều cao bơm mẫu 10 cm, thời gian bơm mẫu là 15 s
Các kết quả khảo sát thành phần dung dịch đệm thể hiện trong bảng 3.1; hình 3.1; hình 3.2.
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc diện tích pic của MA, MDA, MDMA và MDEA vào thành phần hệ đệm điện di 1200 1000 800 600 400 200 MA MDA MDMA MDEA
Thêi gian di chuyÓn (s) His/Asc Arg/Phos Arg/Ace Arg/Asc 10 mV MA MDA MDMA MDEA
Hình 3.1. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của MA, MDA, MDMA, MDEA
Chất phân tích Nồng độ (ppm) Diện tích pic (mV.s) Đệm Arg/Phos Đệm His/Asc Đệm Arg/Asc Đệm Arg/Ace MA 40,0 48,8 36,4 50,8 51,6 MDA 166,5 28,5 10,3 29,8 30,1 MDMA 83,0 20,6 12,0 22,9 23,0 MDEA 73,5 18,1 34,6 32,5 34,8
48,8 36,4 50,8 51,6 28,5 10,3 29,8 30,1 20,6 12 22,9 23 18,1 34,6 32,5 34,8 0 10 20 30 40 50 60
Arg/Phos His/Asc Arg/Asc Arg/Ace
Diệ n tí ch pi c ( mV .s)
MA MDA MDMA MDEA
Hình 3.2. Sự phụ thuộc diện tích pic của MA, MDA, MDMA, MDEA vào thành phần hệ đệm điện di
Từ các kết quả trên cho thấy, hệ đệm sử dụng hợp phần bazơ là histidin cho đƣờng nền khơng tốt, độ phân giải thƣờng thấp và tín hiệu của các chất nhỏ hơn nhiều so với hệ đệm sử dụng hợp phần bazơ là arginin. Trong 3 hệ đệm sử dụng Arginin thì hệ đệm sử dụng axit acetic cho kết quả đƣờng nền, diện tích pic và độ phân giải giữa các pic tốt hơn hệ đệm sử dụng axit ascorbic và phosphoric. Vì thế, hệ đệm này đƣợc chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.2. Khảo sát pH của dung dịch đệm điện di
Với một hệ đệm nhất định thì giá trị pH là yếu tố quyết định trực tiếp đến quá trình tách điện di của các chất. Khi giá trị pH thay đổi sẽ làm thay đổi độ điện di và tốc độ di chuyển của dịng EOF. Do đó cơng việc quan trọng là phải tìm đƣợc giá trị pH thích hợp và giữ khơng đổi trong suốt q trình điện di. Qua tham khảo tài liệu [15], chúng tôi nhận thấy giá trị pH = 4,5 là phù hợp để tách các chất. Vì vậy, khoảng pH đƣợc chọn để thực hiện việc khảo sát nhằm tìm ra giá trị pH phù hợp nhất là: 4,0 - 6,0. Các điều kiện khác dùng để khảo sát bao gồm:
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tƣơng ứng với nồng độ của MA: 40,0 ppm, MDA: