CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.5. Giới thiệu chung về phƣơng phỏp điện di mao quản (CE)
1.5.3. Nguồn điện thế cao
Là nguồn thế V một chiều nhất định đƣợc ỏp vào hai đầu mao quản để tạo ra lực điện trƣờng E và dũng điện I trong mao quản. Nú điều khiển và duy trỡ sự điện di của cỏc chất.
Điện thế V một chiều thƣờng đƣợc dựng là từ 15 - 40 kV/1m, hoặc từ 150 – 550 V/1cm mao quản để khụng cho dũng điện I quỏ lớn mà chỉ nờn nằm trong vựng từ 10 - 75 àA. Việc chọn điện thế V là tựy thuộc vào bản chất của chất phõn tớch, chất nền của mẫu, giỏ trị pH và nồng độ của pha động điện di…[6].
1.5.4. Cỏc kỹ thuật bơm mẫu trong phương phỏp điện di mao quản
Tựy theo trang thiết bị, đối tƣợng phõn tớch và mục đớch phõn tớch khỏc nhau mà cú thể lựa chọn một kiểu bơm mẫu phự hợp trong 3 kiểu sau:
Hỡnh 1.6. Cỏc kĩ thuật bơm mẫu trong phương phỏp điện di mao quản
* Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động lực học dựng ỏp suất
Trong kĩ thuật này (hỡnh 1.7-A): Dựng ỏp suất thớch hợp để nộn (đẩy) hoặc hỳt một lƣợng mẫu bơm vào đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định.
* Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động lực học kiểu xiphụng
Trong kĩ thuật này (hỡnh 1.7-B): Dựa vào sự chờnh lệch về chiều cao của hai đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định. Độ cao chờnh lệch thƣờng từ 10 - 30 cm trong vài giõy đến vài phỳt tựy thuộc vào hỗn hợp mẫu phõn tớch.
* Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học
Kĩ thuật này (hỡnh 1.7-C) sử dụng lực điện khi ỏp thế cao (5 - 10 kV trong vài giõy) để bơm mẫu vào mao quản trong thời gian nhất định. Ƣu điểm của kĩ thuật này là cho kết quả cỏc pic phõn tỏch cú độ sắc nột cao, nhƣng lại cú nhƣợc điểm rất lớn là diện tớch pic (khi định lƣợng) cú độ lặp lại thấp với cỏc nền mẫu khỏc nhau nờn chỉ thƣờng dựng để định tớnh [6].
1.5.5. Detector trong phương phỏp điện di mao quản
Detector là bộ phận cú tỏc dụng phỏt hiện và ghi nhận tớn hiệu của chất phõn tớch sau quỏ trỡnh điện di. Tựy thuộc vào tớnh chất của hỗn hợp mẫu mà lựa chọn detector phự hợp. Cỏc loại detector thƣờng dựng trong phƣơng phỏp điện di mao quản bao gồm: Hấp thụ phõn tử (UV-Vis), huỳnh quang phõn tử, phỏt xạ hoặc hấp thụ nguyờn tử, phổ khối, điện thế (đo dũng, đo thế, đo độ dẫn), độ dẫn nhiệt, chỉ số chiết suất của chất [9]
Ngày nay ngƣời ta đặc biệt quan tõm và phỏt triển loại detector đa năng nhƣ detector đo độ dẫn khụng tiếp xỳc (CE-C4D). Nú đƣợc sử dụng khỏ hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khỏc nhau của khoa học, cụng nghệ, kinh tế và y dƣợc.
* Detector đo độ dẫn khụng tiếp xỳc (C4
D) [1]
Detector đo độ dẫn là một trong những loại detector đƣợc đặc biệt chỳ ý, mặc dự thƣờng cú độ nhạy thấp hơn so với một vài kĩ thuật điện húa khỏc nhƣng lại cú ƣu điểm là đa năng cú thể dựng cho rất nhiều loại chất phõn tớch khỏc nhau. Thờm vào đú là nú cú thể thu nhỏ dựng cho cỏc mao quản cú đƣờng kớnh hẹp, thậm chớ cho cỏc microchip mà khụng ảnh hƣởng đến độ nhạy và cỏc tớnh chất khỏc của detector.
Cảm biến đo độ dẫn khụng tiếp xỳc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục xuất hiện lần đầu trờn thế giới vào năm 1998. Đến năm 2002, nhúm nghiờn cứu của GS Peter Hauser (khoa Húa, trƣờng đại học Basel, Thụy Sỹ) đó phỏt triển thành cụng dũng sản phẩm C4D với nguồn điện thế kớch thớch xoay chiều cao (HV-C4D, 200V). Sau đú Hóng điện tử eDAQ của Úc đó phối hợp cựng với nhúm nghiờn cứu của GS. Peter Hauser để phỏt triển nghiờn cứu này. Nguyờn lý hoạt động của detector đƣợc thể hiện trong hỡnh 1.8.
Hỡnh 1.7. Nguyờn lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn khụng tiếp xỳc
Khi ỏp nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) vào điện cực thứ nhất, tại điện cực thứ hai xuất hiện tớn hiệu đo ở dạng cƣờng độ dũng điện (I). Vỡ vậy, dũng điện thu đƣợc tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f.
Vđo = I x Rfeedback
Tớn hiệu đầu ra thu đƣợc ở dạng cƣờng độ dũng điện (xoay chiều), sau đú sẽ đƣợc chuyển đổi và khuếch đại thành tớn hiệu dạng vụn thế (xoay chiều), thụng qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại (Rfeedback). Vụn thế xoay chiều sau đú đƣợc chuyển đổi thành vụn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cựng chuyển đổi thành tớn hiệu số húa trƣớc khi đƣợc hiển thị và lƣu trữ trờn mỏy tớnh.
Hỡnh 1.8. Quỏ trỡnh chuyển đổi tớn hiệu của C4D
Nhƣ vậy, detector đo độ dẫn khụng tiếp xỳc ngoài ƣu điểm là phõn tớch đa năng cũn cú lợi thế là khụng nhất thiết phải cú sự tiếp xỳc trực tiếp của cỏc điện cực với dung dịch đo. Đú là do lợi dụng đƣợc tớnh chất kết nối tụ điện với dung dịch bờn trong mao quản hoặc ống phản ứng. Đõy là một cỏch rất thụng minh loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của điện thế cao đến hệ điện tử của detector đảm bảo an toàn và khụng làm nhiễm bẩn dung dịch phõn tớch, trong quỏ trỡnh phõn tỏch điện di.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Mục tiờu và nội dung nghiờn cứu 2.1. Mục tiờu và nội dung nghiờn cứu
2.1.1. Mục tiờu nghiờn cứu
Mục tiờu của đề tài là: Nghiờn cứu quy trỡnh giỏm định một số chất ma tỳy tổng hợp nhúm ATS (gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA) trong mẫu nƣớc tiểu và mẫu bị bắt giữ (Viện Khoa học Hỡnh sự cung cấp) bằng phƣơng phỏp điện di mao quản, sử dụng detector đo độ dẫn khụng tiếp xỳc theo kiểu kết nối tụ điện (CE-C4D).
2.1.2. Nội dung nghiờn cứu
Trờn cơ sở mục tiờu đề ra, nội dung đề tài bao gồm:
- Tổng hợp cỏc tài liệu liờn quan đến cỏc chất ma tỳy tổng hợp nhúm ATS và cỏc phƣơng phỏp phõn tớch.
- Nghiờn cứu khảo sỏt cỏc điều kiện tối ƣu cho việc giỏm định đồng thời 4 chất ma tỳy tổng hợp nhúm ATS gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA bằng phƣơng phỏp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn khụng tiếp xỳc (CE-C4D), gồm:
+ Khảo sỏt hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm. + Khảo sỏt thời gian bơm mẫu.
+ Khảo sỏt điện thế đặt vào hai đầu mao quản.
+ Khảo sỏt sự ảnh hƣởng của cỏc cation đến việc giỏm định cỏc chất. - Thẩm định, đỏnh giỏ phƣơng phỏp phõn tớch
+ Xõy dựng đƣờng chuẩn, xỏc định khoảng tuyến tớnh (khoảng làm việc). + Xỏc định giới hạn phỏt hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). + Đỏnh giỏ độ chụm của phƣơng phỏp phõn tớch.
+ Đỏnh giỏ độ đỳng của thiết bị và của phƣơng phỏp phõn tớch.
- Áp dụng phõn tớch hàm lƣợng 04 chất ma tỳy tổng hợp trong một số mẫu thực tế: mẫu bị bắt giữ và mẫu nƣớc tiểu do Viện Khoa học Hỡnh sự cung cấp.
- Thực hiện phõn tớch đối chứng một số mẫu cú hàm lƣợng cỏc chất ma tỳy với phƣơng phỏp phõn tớch tiờu chuẩn GC/MS do Viện Khoa học Hỡnh sự thực hiện.
2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Phương phỏp phõn tớch
Phƣơng phỏp phõn tớch trong luận văn là phƣơng phỏp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn khụng tiếp xỳc (CE-C4D). Thiết bị này đƣợc thiết kế và chế tạo bởi TS. Mai Thanh Đức và ThS Bựi Duy Anh kết hợp với nhúm nghiờn cứu của GS. Peter Hauser (Thụy Sỹ), là thiết bị cú nguồn thế cao lờn đến 20 kV, cú thể thực hiện bỏn tự động (hỡnh 2.1).
Hỡnh 2.1. Hệ điện di sử dụng detector đo độ dẫn khụng tiếp xỳc 2.2.2. Phương phỏp xử lý mẫu 2.2.2. Phương phỏp xử lý mẫu
Cỏc mẫu đƣợc sử dụng trong luận văn gồm mẫu viờn thuốc bị bắt giữ và mẫu nƣớc tiểu thu đƣợc ở hiện trƣờng cỏc vụ ỏn hoặc tại cỏc trại giam do Viện Khoa học Hỡnh sự cung cấp.
2.2.2.1. Xử lý mẫu viờn thuốc
Lấy 1 viờn thuốc nghiền thành bột và trộn đều. Cõn 1 lƣợng bột chớnh xỏc (26,0 mg MA viờn; 11,4 mg MA đỏ; 57,0 mg MDMA viờn) trờn cõn phõn tớch (độ chớnh xỏc 0,1 mg). Sau đú cho vào bỡnh định mức 10,0 mL, thờm 3,0 mL metanol (Riờng MDMA thờm 4 mL methanol vỡ mẫu này ở dạng bazơ khú tan), siờu õm khoảng 10 phỳt và định mức tới vạch bằng nƣớc đề ion. Hỗn hợp đƣợc ly tõm (8000 vũng/phỳt) trong 10 phỳt, tiếp đến đƣợc lọc qua màng 0,2 àm và pha với tỉ lệ thớch hợp bằng nƣớc đề-ion trƣớc khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE.
2.2.2.2. Xử lý mẫu nước tiểu
18 mẫu nƣớc tiểu thu trong vụ “Tổ chức sử dụng trỏi phộp ma tỳy” đó đƣợc phõn tớch sàng lọc bằng phƣơng phỏp thử miễn dịch (Cỏc mẫu đƣợc đỏnh số thứ tự từ 1 - 18 ). Kết quả cú 12/18 mẫu dƣơng tớnh ma tỳy nhúm ATS. Vỡ hàm lƣợng ma tỳy trong nƣớc tiểu thƣờng nhỏ nờn cần đƣợc chiết xuất để làm giàu mẫu và loại bỏ bớt tạp chất trƣớc khi bơm mẫu vào thiết bị CE. Sau khi tham khảo tài liệu [2, 20] và căn cứ vào cỏc điều kiện thiết bị, húa chất cú trong phũng thớ nghiệm, chỳng tụi thực hiện qui trỡnh chiết xuất ma tỳy nhúm ATS trong mẫu nƣớc tiểu nhƣ sau:
1. Lấy mỗi mẫu 5 mL nƣớc tiểu vào ống nghiệm cú nắp xoỏy
2. Kiềm húa mẫu về pH: 10-11 bằng dung dịch NH3 (kiểm tra bằng giấy quỳ) 3. Chiết mẫu bằng 2 mL etyl axetat, lắc trong vũng 10 phỳt
4. Ly tõm cho tỏch lớp
5. Hỳt lớp etyl axetat (lớp trờn) đuổi dung mụi, đƣợc cặn chiết
6. Cặn chiết hũa tan vào 100 L methanol rồi tiến hành phõn tớch trờn thiết bị CE-C4D và/hoặc GC-MS.
2.3. Cỏc thụng số đỏnh giỏ độ tin cậy của phƣơng phỏp phõn tớch
2.3.1. Giới hạn phỏt hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
* Giới hạn phỏt hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phõn tớch mà hệ thống phõn tớch cũn cho tớn hiệu phõn tớch khỏc cú nghĩa so với tớn hiệu mẫu trắng hay tớn hiệu nền.
Đối với cỏc quỏ trỡnh sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ lệ tớn hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [13].
* Giới hạn định lƣợng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phõn tớch mà hệ thống phõn tớch định lƣợng đƣợc với tớn hiệu phõn tớch khỏc cú ý nghĩa định lƣợng với tớn hiệu mẫu trắng hay tớn hiệu của nền. Thụng thƣờng, với cỏc quỏ trỡnh sắc ký giỏ trị LOQ đƣợc xỏc định theo tỉ số tớn hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [13].
2.3.2. Độ chụm ( độ lặp lại) của phương phỏp
Độ lặp lại đặc trƣng cho mức độ gần nhau giữa cỏc giỏ trị riờng lẻ xi khi tiến hành trờn cỏc mẫu thử giống hệt nhau, đƣợc tiến hành bằng một phƣơng phỏp phõn
tớch, trong cựng điều kiện thớ nghiệm (ngƣời phõn tớch, trang thiết bị, phũng thớ nghiệm) trong cỏc khoảng thời gian ngắn [13].
Độ lặp lại của phƣơng phỏp đƣợc xỏc định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) theo cỏc cụng thức sau [10, 13]:
1 2 n S S SD i tb (2.1) ; % x100 S SD RSD tb (2. 2) Trong đú:
- Si là diện tớch của pic điện di thứ i - Stb là diện tớch trung bỡnh của n lần chạy - n là số lần chạy lặp (n = 6)
2.3.3. Độ đỳng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương phỏp
Độ đỳng chỉ mức độ gần nhau giữa giỏ trị trung bỡnh của dóy lớn cỏc kết quả thớ nghiệm và cỏc giỏ trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đú, thƣớc đo độ đỳng thƣờng đỏnh giỏ qua sai số tƣơng đối hay bằng phƣơng phỏp xỏc định độ thu hồi [10, 13]. Độ thu hồi (H): 100 lt tt C C H (2.3) Trong đú:
H: hiệu suất thu hồi (%)
Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phõn tớch thu đƣợc (tớnh theo đƣờng chuẩn) Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phõn tớch tớnh toỏn từ lƣợng chuẩn thờm vào. Nếu chất chuẩn thờm vào mẫu từ trƣớc khi xử lý mẫu ta cú độ đỳng của phƣơng phỏp, cũn nếu chất chuẩn đƣợc thờm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị CE ta cú độ đỳng của thiết bị. Ngoài ra, độ đỳng của phƣơng phỏp cũn đƣợc khẳng định qua việc so sỏnh kết quả thực nghiệm với kết quả đo của một phƣơng phỏp đối chứng tiờu chuẩn khỏc.
2.4. Thực nghiệm
2.4.1. Húa chất
Cỏc húa chất dựng trong phƣơng phỏp đều thuộc loại tinh khiết phõn tớch.
2.4.1.1. Chất chuẩn
+ MA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ =66,7%) + MDA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 82,8%) + MDMA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 40,0%) + MDEA (Lipomed, hàm lƣợng dạng bazơ = 84,66%)
2.4.1.2. Húa chất dung mụi
+ L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lƣợng > 99,5%)
+ L- Histidine ( C6H9N3O2) ( Fluka, hàm lƣợng 99,5%) + Axit acetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)
+ Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức) + Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) + Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)
Nƣớc siờu tinh khiết (nƣớc đề-ion): là nƣớc cất hai lần đƣợc lọc qua bộ lọc siờu tinh khiết với cỏc cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 àm
2.4.1.3. Chuẩn bị cỏc dung dịch húa chất
* Pha dung dịch chuẩn gốc
Cõn riờng từng chất trờn cõn phõn tớch (độ chớnh xỏc 0,1 mg) MA: 81,8 mg, MDA: 5,0 mg, MDMA: 96,1 mg, MDEA: 11,3 mg đƣợc pha trong dung mụi là methanol với lƣợng thớch hợp: MA: 3 mL, MDA: 2 mL, MDMA: 4 mL, MDEA: 4 mL, rung siờu õm trong 30 phỳt, sau đú thờm vào mỗi dung dịch 1 mL nƣớc thu đƣợc cỏc dung dịch gốc cú nồng độ tƣơng ứng là MA: 13600 ppm, MDA: 1380 ppm, MDMA:7690 ppm, MDEA: 1910 ppm. Dung dịch đƣợc bảo quản trong tủ lạnh từ 2 - 8oC, trỏnh ỏnh sỏng và cú thể sử dụng trong vũng 1 năm.
Từ dung dịch chuẩn trờn ta cú thể pha cỏc dung dịch hỗn hợp 4 chất chuẩn (tỉ lệ nồng độ (ppm) MA : MDA : MDMA : MDEA là 2 : 8,3: 4,2 : 3,7 để làm việc cú
cỏc nồng độ khỏc nhau tƣơng ứng với nồng độ MA là: từ 0,3 – 90 ppm. Cỏc dung dịch làm việc đƣợc pha hàng ngày.
* Pha dung dịch đệm
Cỏc dung dịch đệm điện di đƣợc pha hàng ngày. Chất đệm đƣợc cõn và pha trực tiếp vào bỡnh định mức bằng nƣớc đề-ion, sau đú đƣợc rung siờu õm 10 phỳt và chuẩn lại giỏ trị pH cần thiết trƣớc khi sử dụng.
2.4.2. Thiết bị dụng cụ
* Thiết bị
- Thiết bị điện di mao quản CE-C4D nhƣ đó trỡnh bày ở mục 2.2.1. - Mỏy lọc nƣớc đề-ion của hóng Sientech (Mỹ)
- Mỏy rung siờu õm, cú gia nhiệt của hóng BRANSONIC 521
- Mỏy đo pH của hóng HANNA với điện cực thủy tinh và cỏc dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của mỏy đo pH
- Cõn phõn tớch của hóng SÂientech (Mỹ), độ chớnh xỏc 0,0001 g - Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dựng bảo quản mẫu
- Mỏy ly tõm LCEN-200 * Dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bỡnh định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh, pipet, micro pipep.
- Pipetman với cỏc cỡ: 20; 100; 200; 1000 và 5000 àL và đầu tớp tƣơng ứng - Cỏc bỡnh định mức nhựa polipropilen (PP) 25 và 100 mL đƣợc sử dụng để pha cỏc dung dịch gốc của cỏc chất phõn tớch và cỏc dung dịch đệm
- Cỏc lọ Falcon 15 mL, 45 mL và lọ polypropylen (PP) để đựng cỏc dung dịch chuẩn
- Đầu lọc cú đƣờng kớnh lỗ lọc 0,2 àm và 0,45 àm - Cỏc xy lanh cú đầu lọc để lọc mẫu
- Mao quản đƣờng kớnh trong 50 àm, chiều dài 60 cm - Cỏc dụng cụ thụng thƣờng khỏc của phũng thớ nghiệm
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiờn cứu khảo sỏt để tối ƣu điều kiện tỏch MA, MDA, MDMA, MDEA
bằng phƣơng phỏp điện di mao quản CE-C4D
Việc nghiờn cứu khảo sỏt một số điều kiện tỏch cỏc chất MA, MDA, MDMA, MDEA đƣợc thực hiện trờn hệ thiết bị CE-C4D với cột mao quản cú chiều dài 60 cm, đƣờng kớnh trong 50 àm. Mẫu đƣợc bơm vào mao quản bằng phƣơng phỏp thủy động lực học theo kiểu xi phụng bằng cỏch nõng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lờn ở độ cao 10 cm so với đầu mao quản cũn lại. Độ cao này đƣợc cố định trong tất cả cỏc thớ nghiệm.
3.1.1. Khảo sỏt ảnh hưởng của hệ đệm
Trong phƣơng phỏp CE, cỏc yếu tố: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm cú ảnh hƣởng rất lớn đến dũng điện di thẩm thấu (EOF) và tốc độ di chuyển phõn tử của cỏc chất trong mao quản. Chỳng ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng tỏch cỏc chất trong quỏ trỡnh phõn tớch. Vỡ vậy, cần thiết phải khảo sỏt lựa chọn điều kiện tối ƣu cho cỏc thụng số này trong điều kiện cụ thể. Ngoài ra, cần phải khảo sỏt thờm cỏc yếu tố khỏc cũng gõy ảnh hƣởng đến khả năng tỏch và/hoặc