Sau khi phân lập được bốn hợp chất Cacbonylαβ không no tinh khiết: Tonkinin(1), Zerumbone (2), Rutin (3) và Curcumin (4) từ bốn cây thuốc dân tộc mà đã có tín hiệu chống ung thư và bệnh viêm loét dạ dày, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư với hai dịng ung thư người Hep G2 và biểu mơ vú MCF 7 và hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn Helycobacter Pylori (HP) là tác nhân gây bệnh viêm loét dạ dày với hy vọng tìm được mối liên hệ cấu tạo phân tử và hoạt tính sinh học chống ung thư và bệnh viêm loét dạ dày của các chất được thử.
O O OCH3 OH CH3O HO O O H CH3O HO OCH3 OH
Tonkinin (1) Zerumbone (2)
Rutin (3)
Curumin I (4)
3.3.1. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất phân lập được
Việc thử nghiệm hoạt tính chống ung thư của Tonkinin, Zerumbone, Rutin và Curcumin I tiến hành theo phương pháp hiện nay được tiến hành ở NIC của Mỹ và các
O OH ACO 1 2 3 4 5 6 7 15 16 17 18 19 20 O O O OCH3 OH CH3O HO
dòng ung thư Hep 2 và MCF 7 cũng do Viện này cung cấp kết quả thu được chỉ ra trên bảng 3.4 và 3.5.
Bảng 3.4 Hàm lượng % tế bào ung thư sống sót sau phép thử
STT Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (µg/ml) Tỉ lệ (%) sơng sót tế bào Kết luận Hep G2 MCF7 DMSO 5 100,0±0,0 100,0±0,0 Âm tính Chứng (+) 5 0,2±0,0 0,8±0,2 Dương tính 1 Mẫu 1 Zerumbone 5 49,2±0,9 73,3±1,6 Dương tính với dịng Hep G2 2 Mẫu 2 Tonkinin 5 0,8±0,1 29,3±0,4 Dương tính với dịng G2 và MCF7 3 Mẫu 3 Curcumin 5 83,1±0,9 79,3±0,5 Âm tính 4 Mẫu 4 Rutin 5 86,6±1,1 82,4±0,7 Âm tính
Bảng 3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu của các chất thử đối với tế bào ung thư
STT Ký hiệu mẫu IC50 µg/ml Kết luận Hep G2 MCF7 DMSO 100,0±0,0 100,0±0,0 Âm tính Chứng (+) 0,22 0,18 Dương tính
Zerumbone Hep G2 6 Mẫu 2
Tonkinin
0,108 1,804 Dương tính với dịng G2 và MCF7
Kết quả bảng 2 cho thấy hàm lượng % tế bào ung thư của cả 2 loại Hep G2 và MCF7 sống sót sau phép thử đối với Tonkinin là nhỏ nhất sau đó là Zerumbone rồi Curcumin I, cuối cùng là Rutin. Nói một cách khác, cường độ diệt tế bào ung thư Hep G2 và MCF7 của Tonkinin là mạnh nhất, sau đó là Zerumbone cịn Curcumin và Rutin hầu như khơng tác dụng (âm tính).
Nồng độ ức chế tối thiểu của Tonkinin với Hep G2 mạnh gấp 47 lần Zerumbone (0,108 so với 4,709 µg/ml) đối với MCF7 Zerumbone hầu như khơng có tác dụng cịn Tonkinin có tác dụng tốt IC50=1,804µg/ml.
Để giải thích trường hợp này, chúng ta quay lại cơ chế chống ung thư của Zerumbone như đã trình bày trong phần tổng quan. Theo Akira Mutakami và cộng sự[10] để có hoạt tính chống ung thư thì hợp chất phải có sự cộng hợp ái nhân của glutathiol S- tranferase có nhiều trong tế bào ung thư vào nhóm chức cacbonyl αβ khơng no theo phản ứng cộng hợp Michael để làm tăng thế oxi hóa khử của tế bào ưng thư và đẩy nhạnh sự tự chết (apoptosis) của tế bào ung thư, làm cho ung thư không phát triển được. Như vậy, khả năng tham gia phản ứng cộng hợp ái nhân của hợp chất cacbonyl αβ không no quyết định hoạt tính chống ung thư của hợp chất đó. Trên cơ sở này, chúng ta xét khả năng tham gia phản ứng cộng hợp ái nhân của Tonkinin, Zerumbone, Rutin và Curcumin I.
Ở Tonkinin trung tâm phản ứng là nhóm Metylen đầu mạch, khơng có nhóm thế (C17) nên khơng gian tác dụng là rất lớn vì hiệu ứng án ngữ khơng gian là khơng có. Hơn nữa dưới tác dụng của độ âm điện lớn của oxi, liên kết của oxi và cacbon 16 bị chuyển
dịch về phía oxi kéo theo sự phân cực mạnh liên kết đôi α, β và tạo ra trung tâm phản ứng ái nhân mang điện tích dương phần ở nguyên tử C17
Như vậy cả 2 yếu tố quyết định khả năng tham gia phản ứng cộng hợp ái nhân là điện tích dương và án ngữ không gian ở Tonkinin đều lớn hơn rất nhiều ở Zerumbone,
Rutin và Curcumin. Nên hoạt tính chống ung thư của Tonkinin là mạnh nhất trong 4 chất đem thử. Ở Rutin hoạt tính chống ung thư gần như khơng có vì liên kết đôi αβ nằm trong hệ liên kết đơi liên hợp mang tính thơm nên khơng có khả năng phân cực hóa do ảnh hưởng của độ âm của điện ngun tử oxi của nhóm cacbonyl. Cịn ở Zerumbone vì có 2 liên kết đơi αβ liên hợp với một nhóm cacbonyl, nên ảnh hưởng của sự phân cực bởi độ âm điện của oxi bị yếu đi rất nhiều nên khả năng cộng hợp ái nhân cũng yếu đi. Vì vậy hoạt tính chống ung thư của Zerumbone yêu hơn Tonkinin. Ở Curcumin I do hiện tượng tautome hóa xeton-enol (xem hình 3.7) của nhóm cacbonyl với nhóm metylen tạo nên hệ liên kết đôi liên hợp kéo dài trong tồn phân tử. Do đó khả năng tạo ra trọng trung tâm cộng ái nhân khơng cịn nữa, do đó hoạt tính chống ung thư của curcumin I cũng rất yếu.
3.3.2. Khảo sát hoạt tính diệt vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) của các chất phân lập đƣợc
Việc thử nghiệm tiến hành theo phương pháp của WHO và chủng mẫu HP do WHO cung cấp, tiến hành thử nghiệm 4 chất mỗi chất ở ba nồng độ khác nhau 0,1mg/ml; 1mg/ml; 10mg/ml trên nồng độ vi khuẩn HP là 1 triệu con/1ml đối với hai loại HP và HP tự phân lập, kết quả thu được chỉ ra trên bảng 3.6.
Bảng3.6: Kết quả thử tiêu diệt HP của các chất phân lập được Mẫu Mẫu Nồng độ vi khuẩn Mẫu số 1 (Zerumbone) Mẫu số 2 (Tonkinin) Mẫu số 3 (Curcumin) Mẫu số 4 (Rutin) 10 mg/ml 1 mg/ml 0,1 mg/ml 10 mg/ml 1 mg/ml 0,1 mg/ml 10 mg/ml 1 mg/ml 0,1 mg/ml 10 mg/ml 1 mg/ml 0,1 mg/ml H.pylori NCTC 11638 106 7x103 8x104 106 0 0 6x104 9x103 5x104 106 3x104 9x105 106 H.pylori 524N13 106 5x103 4x105 106 0 0 9x103 7x103 3x104 106 6x104 6x105 106
Kết quả trên cho thấy, Tonkinin phân lập từ cây khổ sâm Bắc Bộ là một tác nhân diệt khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gây viêm loét dạ dày Helicobacter Pylori (HP). Ở nồng độ 01mg/ml thì Tonkinin diệt 100% khuẩn HP có nồng độ 1 triệu con/ml đối với cả khuẩn HP mẫu và khuẩn HP phân lập từ bệnh phẩm. Trong lúc đó, ở nồng độ này thì Zerumbone, Curcumin I và Rutin hầu như khơng có tác dụng. Kết quả này thật là thú vị vì nó cho thấy việc y học dân tộc dùng khổ sâm Bắc Bộ để chữa bệnh viêm loét dạ dày là hợp lý và có cơ sở khoa học. Kết quả này cũng là kết quả đầu tiên về hoạt tính chống vi khuẩn HP của Tonkinin và cây khổ sâm Bắc Bộ, Việt Nam.
Để giải thích vì sao Tonkinin có tác dụng diệt HP mạnh trong lúc đó Curcumin, Zerumbone và Rutin khơng có tác dụng, cần nhiều nghiên cứu hơn nữa.
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu đề tài chúng tôi rút ra các kết luận sau đây:
1. Đã xây dựng được bốn quy trình phân lập có hiệu quả bốn chất cacboxyl αβ không no: Tonkinin, Zerumbone, Curcumine I và Rutin từ bốn cây thuốc dân tộc tương ứng: Khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep), gừng gió (Zingiber zerumbet Smith), nghệ vàng (Curcuma longa L) và hoa hòe (Sophora japonica L), cho hiệu xuất tốt, sản phẩm chất lượng cao. Đã cải tiến quy trình phân lập Tonkinin của tài liệu 14 bằng dung môi chiết và kết tinh lại sản phẩm; đã xây dựng được phương pháp mới phân lập Zerumbone từ củ gừng gió; cải tiến phương pháp phân lập Rutin từ hoa hòe bằng cách dùng DBSA.
2. Đã khảo sát so sánh hoạt tính chống ung thư của bốn chất trên đối với hai dòng ung thư người: Ung thư gan Hep G2 và ung thư biểu mơ vú MCF7 và nhận thấy Tonkinin có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất đối với cả hai dòng tế bào ung thư người được thử (hàm lượng tế bào sống sót 0,8±0,1% và 29,3±0,6% và IC50 là 108 và 1,804 µg/ml), sau đó là
Zerumbone (hàm lượng tế bào sống sót của HepG2 là 49,2±0,9% IC50 là 4,709 âm tính với MCF 7). Còn 2 chất Curcumin I và Rutin khơng có hoạt tính gây độc đối với hai loại ung thư trên.
3. Đã khảo sát hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh viêm loét dạ dày dòng Helicobacter pylori của bốn hợp chất trên và nhận thấy Tonkinincó hoạt tính tiêu diệt 100% vi khuẩn được thử, ở nồng độ 106 vi khuẩn/1ml với liều 1mg/1ml thuốc thử, các chất cịn lại khơng có tác dụng. Kết quả này minh chứng cho việc sử dụng khổ sâm Bắc Bộ làm thuốc chữa bệnh dạ dày trong dân tộc cổ truyền là hợp lý. Tonkinin (ent- 7β- hydroxykaur-16-ene-15-one) phân lập từ cây khổ sâm Bắc Bộ lần đầu tiên được khảo sát hoạt tính chống vi khuẩn gây bệnh viêm loét dạ dày Helicobarter Poleri (HP) và khẳng định nó có hoạt tính kháng HP mạnh.
Cây khổ sâm Bắc bộ
Zerumbone từ củ Cây gừng gió
Rutin từ cây hoa hịe
Tài liệu tham khảo 1. Võ Văn Chi;
1997 Từ điền các công thức thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 335-338.
2. Michael Reaction Wikipedia org/Wiki/Michael Reaction. 3. Dev
1960,Serquiterpene in the oil of Zingber zerumbet Sm in India,
Tetrahedron 8,171-180,.
4. Heshu Sulaiman Rahman et al;
2014,Biomeidicinal properties of a Natural dietary plant metabolite,
Zerumbone in cancers therapy and chemoprevention trials. Biomed. Research. international 10,20711-20722,.
5. Sharifath Sakynah SA et al;
2007,Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of
Bax/Bel-2 ratio.
Cancer cell Intermational 7:4, 1186-1200. 6. Siddig Ibrahim Abdelwahab et al;
2010, Zerumbone induce apoptosis in T-acute lympro- blastie leukemia cells.
Leukemia Research 35, 268-271. 7. Bolyung Sung et al
2009, Zerumbone abolishes RANKL-Inducel NF-kB actiration Inhibits Osteoclastogenesis and Suppresses Human Breast cancer. Inducel Bone loss in Athymic Nude Mice.
Cancer Res 69, 1477-1484, 8. Abdul et al
2009,United States Patent Application Publication
Pub. N0 US 2009/ 0239953A1, Sep 24. 9. Yasunori Takada et al
2005, Zerumbone abolishes NF-kB and I-kB kinase activation leading to
suppression of antiapoptotic and metastatic gene expression, upregulation of apoptosis, and downregulation of invasion.
10. Akira Murakami et al.
2002, Zerumbone, a Southeast Asian ginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical generation, proinflammatory protein production, and cancer cell proliferation accompanied by apoptosis: the alpha,beta- unsaturated carbonyl group is a prerequisite.
Carcinogenesis 23;795-802; 11. Văn Ngọc Hướng và cộng sự
2004, Gừng gió (Zingiber Zerumbet Sm) vùng Tam Đảo một nguyên liệu quí cho tiền chế Zerumbone.
Tạp chí khoa học và Cơng nghệ 44-65-69;. 12. Murakami A et al.
1999, Identification of zerumbone in Zingiber zerumbet Smith as a potent
inhibitor of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced Epstein-Barr virus activation.
Biosci.Biotechnol. Biochem. 63,1811-1822. 13. Đỗ Tất Lợi
1991, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam
NXB KH-KT.
14. Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phạm Minh Giang, Taylor W.C.
1999, Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ cây khổ sâm cho
lá ( Croton Tonkinensis Gagnep Tạp chí Hóa học 27, 1-3.
15. Geofrey N.Roth et al
1998, Novel Bioactivities of Curcuma longa constituents
J.Nac.Prod 61; 542-545. 16. Trần Cơng Khanh
1998, Tìm hiểu và phân loại cây hòe ở Việt Nam
Tạp chí Dược học 6; 127-130.
17-VI Wikipedia org/wiki/ung thư. Wikipedia tiếng việt 18- VI Wikipedia org/viêm loét. Wikipedia tiếng việt